Избранный 6 ноября 1708 г. гетманом Иван Скоропадский остался верным союзником России.
12 ноября 1708 г. митрополит Киевский, Галицкий и Малыя России Иоасаф (Кроковский, украинец польского происхождения, родом из Львова) в Троицком соборе Глухова в присутствии Петра I ив сослужении других украинских архиереев совершил литургию и молебен, после чего «предал вечному проклятию Мазепу и его приверженцев». В тот же день в Успенском соборе Москвы в присутствии царевича Алексея Петровича украинец по национальности и Местоблюститель Московского Патриаршего престола Митрополит Рязанский и Муромский Стефан (Яворский) в сослужении собора архиереев предал Мазепу анафеме.
Мазепа почти сразу же осознал ошибочность своего поступка. В конце ноября 1708 г., менее чем через месяц после своего перехода, он послал к Петру I миргородского полковника — будущего гетмана Д. Апостола с предложением при его (Мазепином) содействии пленить шведских короля и генералов с последующей их передачей России. Но царь больше тому не доверял.
27 марта 1709 г. в Великих Будищах гетманом Иваном Мазепой, королем Швеции Карлом XII и кошевым атаманом Войска Запорожского Константином Гордиенко был заключен Союзный договор о совместной борьбе против московского царя Петра I. Согласно подписанному документу, Украина провозглашалась «на вечные времена свободной от всякого чужого посягательства», Запорожье присоединялось к шведско-украинскому союзу, шведский король давал обязательство не заключать мира с Россией без выполнения союзных обязательств. Помимо этого Мазепа согласился стать данником польского короля (то есть безвозмездным пользователем земли) с получением гетманства в Белой Руси и титула князя Витебского и Полоцкого воеводств.
27 июня (8 июля) 1709 г. в сражении под Полтавой шведы были наголову разбиты войсками Петра I. Османская империя отказалась выдать беглого гетмана русским властям. Агентуре Преображенского приказа, унаследовавшего функции прежнего Приказа тайных дел, ставится задача разыскать, пленить и живым доставить Мазепу к царю для награждения «Орденом Иуды», специально отлитым в его честь. Церемония не состоялась: 22 сентября (2 октября по новому стилю) 1709 г. в г. Бендеры 70-летний гетман скончался (похоронен в церкви Святого Юрия в Галаце; его преемником стал писарь Пилип Орлик), а в России на всех без исключения украинцев начались гонения как на изменников.
11 мая 1709 г., с помощью реестрового казацкого полковника — агента Преображенского приказа Игната Галагана, который знал систему оборонительных укреплений Сечи, крепость по приказу Петра I за участие запорожцев в войне на стороне шведов была взята, сожжена и полностью разрушена. Она возродилась лишь в 1735 г. при императрице Анне Иоанновне (с этого времени реестровых казаков стали именовать «выборными казаками»).