В 1872 году Кох получил назначение на должность уездного санитарного врача в Вольштейне (ныне Вольштын в Польше). Его врачебные обязанности позволили обнаружить, что в окрестностях Вольштейна среди крупного рогатого скота, а также овец распространено эндемическое заболевание – сибирская язва. Эта опасная болезнь поражала лёгкие, вызывала карбункулы кожи и изменения лимфоузлов. Зная об опытах Луи Пастера над животными, больными сибирской язвой, Кох с помощью микроскопа изучает возбудителя, который, предположительно, вызывает сибирскую язву.
Его исследования впервые доказали бактериальное происхождение заболевания.
В 1876 и 1877 годах публикуются статьи Коха по проблемам сибирской язвы, в чем ему содействовали известные ботаник Фердинанд Кон и патолог Юлий Конгейм. Эти работы приносят ему широкую известность. Также Кох публикует описание своих лабораторных методов, в том числе окраски бактериальной культуры и микрофотографии её строения. Результаты работы Коха были представлены учёным лаборатории Конгейма, в том числе Паулю Эрлиху.
Позже Кох предпринимает попытки найти возбудителя туберкулёза, болезни в то время широко распространённой и являющейся основной причиной смертности. Близость клиники Шарите, заполненной туберкулёзными больными, облегчает ему задачу – он ежедневно, рано утром приходит в больницу, где получает материал для исследований: небольшое количество мокроты или несколько капель крови больных чахоткой.
Однако, несмотря на обилие материала, ему всё же никак не удаётся обнаружить возбудителя болезни. Вскоре Кох понимает, что достичь цели можно только с помощью красителей. К сожалению, обычные красители оказываются слишком слабыми, но спустя несколько месяцев работы ему всё же удается найти необходимые вещества.
Ему удалось обнаружить крохотные, слегка изогнутые палочки – палочки Коха.
24 марта 1882 года, когда объявил о том, что сумел выделить бактерию, вызывающую туберкулёз, Кох достиг величайшего за всю свою жизнь триумфа. В то время это заболевание было одной из главных причин смертности. В своих публикациях Кох выработал принципы «получения доказательств, что тот или иной микроорганизм вызывает определённые заболевания». Эти принципы до сих пор лежат в основе медицинской микробиологии.
Но изучение туберкулеза пршлось прервать – германское правительство отправило ученого в научную экспедицию в Египет и Индию определить причину заболевания холерой.
Работая в Индии, Кох объявил, что он выделил микроб, вызывающий это заболевание – холерный вибрион.
В Индии он занимается изучением чумы.