Другой причиной утраты Тверью позиций стало принятие тверским князем титула «великий князь всея Руси». Прежде только митрополит мог иметь в своем титуле слова «всея Руси». Теперь же, судя по новому титулу, тверской князь — подобно византийскому императору — мог вмешиваться в дела церкви. Наряду с этим такой титул рассматривался и как претензия Твери на подчинение себе всех русских земель. Однако русские князья в то время не стремились к объединению. Даже намек на это в титуле тверского князя оттолкнул их от Твери и сблизил с ее соперницей — Москвой. Кроме того, малые и средние княжества были напуганы растущим военным могуществом Твери. Так Москве досталась роль, которую не смогла сыграть Тверь, — центра последовательного собирания русских земель под единой властью.
В конце лета 1317 г. князь московский Юрий Данилович (1303–1325) сумел выторговать у хана Узбека ярлык на великое княжение. Он обвинил тверского князя в том, что тот якобы отдавал Орде не всю дань и хочет бежать в Ливонию. К этому вскоре добавился еще один повод для преследования князя Михаила Тверского (1282–1218). В ходе военных действий Михаил пленил жену Юрия, сестру хана Узбека Кончаку. Через некоторое время она умерла в Твери, что позволило московскому князю утверждать, что ее будто бы отравил тверской князь. В конце февраля 1318 г. Михаил и Юрий предстали перед ханским судом. В Орде после длительного разбирательства Михаил был убит.
В 1322 г. сыну Михаила тверскому князю Дмитрию удалось получить ярлык на великое княжение. Через три года, встретив в Орде Юрия Московского, который пытался вернуть себе утраченный титул, Дмитрий убил его на глазах хана Узбека. За это через десять месяцев он был казнен. Ярлык на великое княжение получил его брат Александр Тверской. Так в 1326 г. Александр вновь дал Твери шанс занять господствующее положение на Руси. Однако достигнутый им успех оказался недолговечным — ярлык оставался в руках тверского князя всего лишь год.
Позиции Твери, казалось, были окончательно подорваны после подавления в ней восстания против татар (1327). Возглавивший карательный поход на Тверь московский князь Иван Данилович Калита (1325–1340) «людей множество погубиша, а иныа в плен поведоша, а Тверь и вся гради огнем пожгоша». За это Ивану хан даровал ярлык на великое княжение, а вместе с ним — и право собирать дань с русских земель.
Вместе с тем в последней четверти XIV в. начался новый политический, экономический и культурный расцвет Тверского княжества. Ставшее в это время самым влиятельным на северо-востоке, оно переняло роль центра политического равновесия на всем восточноевропейском пространстве.