Детство Колюши проходило в Калужской губернии в имении предков по материнской линии, так называемом Конецполье, на границе Мещовского и Моссальского уездов. Воспитывала его в большинстве своем мать. Отец все время проводил в разъездах: «построил он в бывшей Российской империи около 15 000 верст железных дорог и был крупным инженером-путейцем, создавшим своего рода практическую школу инженеров». Николай должен был также заняться точными науками. Но судьба его пошла по другому пути.
В 1908 г. семья Тимофеевых переехала в Киев, где было главное управление дороги Одесса-Бахмач, которую в то время строил его отец. Николай начал учиться в Императорской Александровской первой киевской гимназии с третьего или четвертого класса (точных данных нет). С той поры началось его увлечение зоологией, а именно «мокрой» зоологией, т. е. гидрофауной. Толчок к этому занятию, предопределившему его дальнейшую судьбу, дал сосед — сахарный миллионер Шелюжко, который был раза в четыре старше Колюши. У Шелюжко имелась крупная рыборазводня аквариумных рыбок, главными импортерами которой были гамбургские рыборазводни. А любознательный Колюша содержал дома до 35–40 аквариумов одновременно. Они занимали две комнаты в квартире. Аквариумы были самых разнообразных размеров: от крупных стеклянных банок до проточных аквариумов длиной более метра, шириной почти в метр и высотой около семидесяти сантиметров. Мальчик довольно быстро сконцентрировал свои интересы на определенных группах животных. Он любил лабиринтовых рыбок (макроподы, гурами, бойцовые рыбки), живородок, разводил отечественных пресноводных рыб, особенно вьюновых, горчаков. Интересно, что рыбки у Николая в аквариумах размножались, откладывали икру и выметывали мальков. Забывая о времени, мальчик зачастую дневал и ночевал в рыборазводнях у богатого соседа.
Но это было не единственное его увлечение. Как и все его сверстники, он лазал по деревьям, участвовал в кулачных боях с другими гимназистами, пускал воздушных змеев. А в свободное время Николай сидел на диване с «Жизнью животных» А.Э. Брема. И все тома знал почти наизусть уже ко времени гимназии! С зоогеографической точки зрения его больше всего интересовала палеарктическая область, но не сама область, а размеры животных, населяющих ее. Он выискивал наидлиннейших и наитяжелейших китов, самых маленьких наземных млекопитающих и т. д.
Вскоре Николай стал совершать экскурсии на ближайшие водоемы, и не только на Днепр, но и на малые реки, пруды, озерца. Так, он привык к зоологическим экскурсиям, порой довольно дальним (благо плавал он, как рыба). Полную свободу мальчик обрел в 8–9 лет. Позже, будучи гимназистом средних классов, пристроился препаратором в только что организованную Днепровскую биологическую станцию. И тогда юному Тимофееву-Ресовскому перестало хватать времени из-за зоологии. Привыкнув к лабораторной обстановке, юноша сам начал собирать коллекционный материал по карповым рыбам бассейна Днепра. Это привело его к постановке интересной проблемы, сводящейся к тому, что сходство водных фаун крупных морских бассейнов (черноморского, волжского) с фаунами левых притоков рек (Десна, Ока) позволяет установить их связь и объяснить путаницу, существовавшую в то время.