Однако наиболее значимым его трудом стал «Химический трактат о воздухе и огне» — свидетельство того, что Шееле за два года до Пристли и Лавуазье открыл кислород. Причем сделал это разными способами: прокаливанием оксида ртути, нагреванием карбоната ртути и карбоната серебра и т. д. Изучая природу огня, ученый задумался над тем, какое участие принимает в горении воздух. Он уже знал, что сто лет назад Р. Бойль доказал: свеча, уголь и всякое другое горючее тело могут гореть только там, где достаточно воздуха. Однако в те времена никто не мог толком объяснить, отчего так происходит и зачем, собственно, горящему телу нужен воздух.
Воздух тогда считался однородным веществом, которое нельзя расщепить на более простые составные части, и Шееле поначалу тоже придерживался такого мнения. Но все изменилось, когда он стал проводить опыты с различными химическими веществами в сосудах, плотно закрытых со всех сторон. Какие бы вещества Шееле ни пытался сжигать в этих сосудах, воздух внутри уменьшался на¹⁄₅, и ту же часть объема заполняла вода. Это натолкнуло ученого на мысль, что воздух не однороден.
Далее Шееле принялся изучать разложение разных веществ (в том числе селитры) путем нагревания и получил газ, который поддерживал дыхание и горение. Вероятно, уже в 1771 г. при нагреве пиролюзита с концентрированной серной кислотой ученый наблюдал выделение «виртольного воздуха», поддерживающего горение, то есть кислорода. Пытаясь раскрыть загадку огня, Шееле неожиданно обнаружил, что воздух — не элемент, а смесь двух газов, которые он называл воздухом «огненным» и воздухом «негодным». Это было величайшим из всех его открытий.
Увы, хотя Шееле и был первым исследователем, получившим чистую пробу кислорода, выводы он опубликовал лишь в 1777 г., позже, чем Джозеф Пристли (1733–1804), поэтому формально и не стал первооткрывателем кислорода.
1 августа 1774 г. Пристли наблюдал выделение «нового воздуха» при нагревании ртутной окалины, находящейся под стеклянным колпаком без доступа атмосферного воздуха, с помощью двояковыпуклой линзы. Ртутная окалина была известна еще алхимикам под названием «меркуриус кальцинатус пер се», или «жженая ртуть», а сейчас это вещество называется оксидом ртути. Полученный при его нагревании газ ученый вывел через трубку в сосуд, заполненный ртутью, а затем из любопытства внес туда тлеющую свечу. Та вспыхнула ярким пламенем, и воодушевленный Пристли записал: «Я поместил под перевернутой банкой, погруженной в ртуть, немного порошка “меркуриус кальцинатус пер се”. Потом взял небольшое зажигательное стекло и направил лучи солнца прямо внутрь банки на порошок. Из порошка стал выделяться воздух, который вытеснил ртуть из банки. Я принялся изучать этот воздух, и меня удивило, даже взволновало до глубины души, что в этом воздухе свеча горит лучше и светлее, чем в обычной атмосфере».