К тому времени были окончательно сформированы два экипажа для выполнения первого полета на «Союзах». Основной экипаж возглавил Владимир Комаров, дублирующий – Юрий Гагарин. В феврале-марте 1967 года они прошли интенсивную подготовку. Комаров и Гагарин осваивали навыки сближения и стыковки кораблей на специальном тренажере, а члены экипажей отрабатывали свои действия по переходу из корабля в корабль в термобарокамере и на борту самолета Ту-104, способного имитировать кратковременную невесомость.
23 апреля 1967 года стартовал пилотируемый корабль 7К-ОК(А), получивший название «Союз-1», с Владимиром Комаровым на борту. На следующий день должен был состояться запуск корабля 7К-ОК(П) с тремя космонавтами. Однако сразу после выведения «Союза-1» на орбиту начались проблемы. Не раскрылась левая панель солнечных батарей. Не работала солнечно-звездная ориентация, поэтому не прошла автоматическая закрутка корабля, что, в свою очередь, привело к разрядке аккумуляторов. Комаров несколько раз пытался выполнить закрутку вручную, но безуспешно. Государственная комиссия, проанализировав ситуацию, приняла решение отменить запуск второго корабля и посадить «Союз-1» досрочно. После разделения отсеков и торможения спускаемого аппарата в высших слоях атмосферы отстрелилась крышка люка контейнера основного парашюта, тормозной парашют раскрылся, но вытянуть большой купол из контейнера не смог. Согласно логике работы в действие был введен запасной парашют, но и он не раскрылся, попав в аэродинамическую «тень» тормозного парашюта. В результате спускаемый аппарат на огромной скорости врезался в землю, разбился и загорелся. Летчик-космонавт Владимир Михайлович Комаров погиб.
Позднее был проведен натурный эксперимент с парашютной системой второго корабля, и выяснилось, что если бы его запуск состоялся в срок, то неизбежно погибли бы еще трое космонавтов. Сотрудники ракетно-космической отрасли получили жестокий урок: космос не прощает ошибок и суеты.
В то же время американцы активно готовились к лунной экспедиции. Параллельно с подготовкой миссий «Джемини» шло конструирование корабля «Аполлон» и трех вариантов ракеты-носителя: «Сатурн-1» (Saturn I), «Сатурн-1Б» (Saturn I-B) и «Сатурн-5» (Saturn V).
Местом старта лунных экспедиций был выбран район мыса Канаверал во Флориде, где уже работал ракетный полигон ВВС США. Побережье к северу от него и часть острова Меррит занял созданный в июле 1962 года Центр стартовых операций НАСА (в ноябре 1963 года его переименовали в Космический центр имени Кеннеди). В мае 1963 года на острове Меррит заложили фундамент гигантского монтажно-испытательного корпуса – здания вертикальной сборки высотой 165 метров. В пяти километрах от него на берегу океана были выстроены два стартовых комплекса LC-39A и LC-39В для ракет «Сатурн-5».