Сначала немногочисленные беглецы, вероятнее всего, скрывались от сложностей жизни в укромных местечках, промышляя охотой и рыбной ловлей. Впоследствии, обрастая народом (в том числе и чисто криминальным элементом, числившимся на родине в розыске), они стали строить целые городки и уже представляли собой внушительную военную силу, подчинявшуюся только выборным атаманам.
Уже в 1496 году рязанский князь Федор Васильевич в грамоте к великому князю Московскому сообщает, что низовья Дона во множестве заселены казаками, промышляющими охотой, рыбной ловлей, сбором меда и воска. То есть живет народ пока что мирно.
Однако довольно быстро донские казаки, благо сабля на поясе висела у каждого, нашли более интересные занятия. Одни нанимались охранять купеческие суда на Волге, другие (из песни слова не выкинешь) грабили пограничные русские селения, третьи угоняли ногайские и турецкие табуны. Не так уж и много времени спустя донцы открыли для себя еще гораздо более выгодный промысел – стали нападать на турецкие и крымские земли (а впоследствии ходили и в Персию). Благо имелось мощное идеологическое основание: бей басурман! Иногда для походов они объединялись с запорожцами, иногда ходили самостоятельно.
Со времен Ивана Грозного отношения Москвы с донскими, волжскими и яицкими казаками были довольно сложными и противоречивыми. Московские цари, быстро увидев в казаках надежный заслон от набегов крымцев, стали посылать на Дон «царево жалованье» – деньги, хлеб, оружие, свинец, порох, зерно и сукно. С другой стороны, Москве крайне не нравилось, что казаки в большом количестве принимают у себя беглых крестьян (но никаких средств воздействия на казачью вольницу не было). Порой набеги казаков на турок и татар приводили к нешуточным трениям Москвы с Бахчисараем и Стамбулом. Русские, конечно, простодушно кругля глаза, отвечали, что-де «воры донские московскому государю не подчиняются ничуть и все творят по собственному их, казаков, воровству». Однако турки с татарами верили плохо, прекрасно зная о «царевом жалованье».
Да и у самих донцов отношения с московитами далеко не всегда были дружественными. Еще при Грозном, в мае 1558 года, «воровские казаки» перебили на Волге отряд царского атамана Филимонова, для того туда и отправленный, чтобы стеречь ногайские табуны от казацких набегов.
В то же время при Грозном донские казаки стали участвовать в войнах Московского царства за пределами своих земель. Принимали участие в осаде и взятии Казани в 1552 году, воевали против поляков и шведов в Ливонскую войну (1553–1583).