В 1535 г. флот иоаннитов совместно с испанскими кораблями совершил один из первых рейдов на алжирских пиратов Хайруддина Барбароссы. Начав поход из Сардинии и города Порто-Фарино, испанцы и рыцари осадили и взяли турецкую крепость Гулетту - арсенал Барбароссы, освободив около 10.000 христианских пленников и захватив 300 пушек и 87 галер. Штурмом был взят и разграблен город Тунис, в котором рыцари не остались, а вернулись домой.
* * *
Во времена Реформации произошли значительные изменения в структуре Ордена.
В 1540 г. в Англии король Генрих VII, яростно боровшийся с папским Римом, запретил деятельность Ордена на подвластной ему территории и конфисковал имущество английских госпитальеров (в Англии Орден был восстановлен указом королевы Виктории лишь спустя более 300 лет - в 1888 г.). Вместо английского "Языка" в структуре Ордена появилась Бавария.
В том же году магистр и рыцари бальяжа Бранденбург приняли лютеранство. Так в Пруссии была образована самостоятельная ветвь Мальтийского ордена, члены которого исповедывали лютеранство*.
{* Бальяж Бранденбурга был признан только в период правления Великого Магистра Пинто де Фонсека (1741-1773), когда все религиозные и другие аспекты, в сложное время существования Ордена, приходилось решать, прежде всего, как экономические и политические. Так, например, в 1763-1764 гг. Великий Магистр, действуя скорее как правитель, нежели как глава религиозного католического Ордена, признал бальяж Бранденбурга как ветвь Мальтийского Ордена, на условиях, что командорства, из которых состоял этот протестантский бальяж, обязаны были вносить регулярные взносы ("респонсии") в общую казну Ордена. Этот прецедент будет впоследствии использован как аргумент при создании Великого Российского (православного) Приорства.}
Войны с Турцией. Потеря Триполи
Осенью 1541 г. флот Ордена участвовал в походе тридцатитысячной армии Карла V на Тунис - опорный пункт североафриканских пиратов. На рейде Алжира испанскую флотилию разметала буря, потопив 15 больших галер и 86 других кораблей. Четыре галеры Мальтийского ордена уцелели и с остатками испанского флота вернулись домой.
В 1547 г. на Мальте ненадолго высадился турецкий отряд, который ограбил несколько селений и быстро покинул остров.
В 1551 г. турецкое войско напало и разграбило плохо укрепленные районы островов Мальта и Гоццо, при этом 6300 местных жителей были угнаны в рабство. Иоанниты начали укрепление островов и своей столицы Gitta notable. У входа в Большую гавань они выстроили форт Сент-Эльмо, заново отстроили форт Сан-Анжело, город Биргу, построили форт Сан-Микаэль для защиты нового города Сенглеа.