Преемник Жерара на посту ректора госпиталя брат Рэймонд Дюпюи называет себя магистром и включает в устав ордена, кроме лечения, защиту христианских паломников. Так орден становится военно-монашеским, а его члены называются теперь странноприимными рыцарями святого Иоанна Иерусалимского. Дюпюи также вводит белый восьмиугольный крест, ставший с тех пор эмблемой ордена и ныне известный как мальтийский. В 1248 году папа Иннокентий IV специально для рыцарей разрешает вместо монашеского клобука черную накидку поверх доспехов с белым крестом на левом плече. В 1259 году папа Александр IV меняет цвет накидки на красный, и с тех пор цвета Ордена госпитальеров остаются неизменными до наших дней.
С образованием Римского Королевства Иерусалим Орден госпитальеров, наряду с тамплиерами и Тевтонским орденом, становится сборным пунктом для всех добровольцев-христиан из Европы. С нарастанием над Иерусалимом новой мусульманской угрозы стремительно растут военная роль и престиж ордена, а вместе с ними поток новобранцев и пожертвований. Кавалерийские полки ордена в Иерусалиме ("туркополы" – то есть отражающие турок) наряду с войсками двух других орденов явились фактически первой и единственной в те времена регулярной армией Запада. Кроме того, признанное за орденом право содержать собственные вооруженные силы и вести войны в защиту христианства в сочетании с независимостью от национальных держав знаменовало явление первой наднациональной структуры, обладающей суверенитетом без наличия собственной территории.
Уже к концу XIII века благодаря новым обширным владениям орден располагал сетью госпиталей-убежищ на всех основных путях паломничества из Европы в Святую землю. Каждый госпиталь управлялся группой рыцарей во главе с командором. Несколько госпиталей объединялись в округ, или бэйливик, во главе с балифом. Округа далее входили в приорства и великие приорства.
Рыцари- госпитальеры святого Иоанна Иерусалимского -последние, кто покинул пылающий Иерусалим, отбитый у христиан 2 октября 1187 года войсками Саладина. Здесь погиб великий магистр Роджер де Мулен. Одна за другой падают христианские крепости на Святой земле. При штурме Газы в 1244 году попадает в плен великий магистр Вильям де Шатонеф. После катастрофы пятого крестового похода в 1249 году во главе со святым Людовиком Французским Орден госпитальеров закрепляется в Акре, в Палестине. Здесь рыцари готовятся к неизбежной осаде последнего оплота христиан на земле Иисуса.
В 1291 году турки-мамлюки после месячной осады довершают месть ислама за кровавое падение Иерусалима в 1099-м. Остатки рыцарей и солдат – монахов ордена бегут на Кипр. Однако если боевой дух тевтонцев и тамплиеров сломлен трагедией на Ближнем Востоке, то Орден госпитальеров под руководством великого магистра Джона де Вильера, наоборот, окреп и полон решимости продолжать дело крестовых походов. Поскольку все земли Восточной Римской Империи, кроме Константинополя, находятся теперь в руках мусульман, поле битвы должно закономерно переместиться с суши на море – в акваторию Средиземного моря.