Одним из важнейших аспектов правления Юстиниана стала религиозная политика государства. Рядом указов 527–529 годов всем инаковеруюшим было предложено перейти в православие. Вне закона были поставлены все еретические культы; им запрещалось иметь свои церковные организации, духовенство, совершать таинства крещения и брака, сохранять храмы. Уклонявшиеся ущемлялись в политических и имущественных правах, лишались права занимать государственные и отчасти муниципальные должности. Как писал Юстиниан, «справедливо, чтобы православные пользовались в обществе большими преимуществами, чем еретики».
Тогда же была закрыта Платоновская Академия в Афинах. Против самаритян, отказавшихся креститься, были двинуты войска. В результате трехлетней ожесточенной войны (529–532) более 20 000 из них были убиты, еще 20 000 продано в рабство за границу, а остальные приняли насильственное крещение.
Полагают, что в Самаритянской войне погибло около 100 000 римских подданных, а плодородная провинция превратилась в пустыню, покрытую пеплом и развалинами. Огромное влияние на политику Юстиниана оказало крупнейшее ранневизантийское восстание «Ника», произошедшее в 532 году в Константинополе.
Восстание началось с конфликта между партиями, жалоб прасинов на безучастное отношение императора к их интересам и на насилия венетов во время зрелищ. Юстиниан решил не вмешиваться в конфликт, который 11 января перерос в вооруженное столкновение между венетами и прасинами, в связи с чем было арестовано 7 человек, приговоренных позже к смертной казни. Нежелание императора помиловать двух осужденных, сорвавшихся с виселицы («спасенных богом»), привело к тому, что в своем негодовании обе партии объединились и покинули ипподром.
Город пришел в движение, и вечером 13 января началось вооруженное выступление. Восставшие разгромили преторий префекта города, воинов, охранявших его, перебили. Было сожжено много государственных учреждений, здание сената, восстание стало обретать более широкий социальный характер. «Погибли, — как писал Прокопий, — многие дома богатых людей и большие богатства».
14 января недовольный молчанием императора народ поджег часть ипподрома и потребовал сместить префекта города и видных чиновников, повинных в злоупотреблениях. Император был вынужден пойти на уступки, но они уже не могли остановить нарастающего недовольства. Выступление против бунтовщиков военного отряда лишь накалило недовольство, и народ ответил на него новыми поджогами. Войскам пришлось отступить. Встал вопрос о низложении Юстиниана.