В ходе войны в зоне Персидского залива в 1991 г. для нанесения бомбовых ударов по Ираку использовались 70 самолетов B-52G, взлетавших с о.Диего- Гарсия в Индийском океане, аэродрома в Джидде (Саудовская Аравия), авиабаз Морон (Испания, близ Севильи) и Фэрфорд (Великобритания). Все задействованные самолеты В-52G выполнили 1624 вылета и сбросили 72 тыс. единиц оружия общей массой более 23315 т (т.е. четверть, а по другим данным около трети, от общей массы 94500 т всех обычных и управляемых бомб, сброшенных за время войны в Персидском заливе). По свидетельству американцев, В-52 был одним из самолетов, которые наиболее часто запрашивались сухопутными силами для подавления иракских наземных сил. Бомбометание осуществлялось с большой высоты по площадным целям на кувейтском театре боевых действий и по аэродромам, промышленным объектам, местам скопления войск и хранилищам на территории Ирака, причем до операции «Буря в пустыне» систематических тренировочных полетов на высотное бомбометание не проводилось, и недостаточно подготовленные экипажи допускали ошибки. Например, документальный кадр, сделанный со спутника, свидетельствует о том, что серия бомб, сброшенных с В-52 по одной из войсковых колонн на марше, легла на большом удалении от дороги, по которой двигалась колонна. Отмечались и технические проблемы: несброс бомб с подвески, отказы механизма открытия створок бомболюка. В то же время, по официальным данным, боеготовность задействованных B-52G превысила 81%, что на 2% выше боеготовности мирного времени.
Наиболее крупной и примечательной операцией бомбардировщиков В-52 в Персидском заливе было первое применение крылатых ракет AGM-86C, снаряженных БЧ обычного типа. На AG- М-86С, представляющих собой модификацию ракет AGM-86B с ядерной БЧ, были установлены фугасные и кассетные БЧ массой по 450 кг. Дальность полета AG- М-86С меньше, чем у ракеты с ядерной БЧ, однако точность наведения выше благодаря применению бортового приемника глобальной спутниковой навигационной системы. КР были применены в январе 1991 г. в первые часы операции «Буря в пустыне» с бомбардировщиков B-52G из состава 2-го бомбардировочного крыла (авиабаза Барксдейл, шт.Луизиана). Основная причина применения КР воздушного базирования была связана с тем, что самолеты многонациональных сил не могли совершать полеты через воздушное пространство Турции, а самолеты F-111 и F-117A, базировавшиеся в Саудовской Аравии, не могли углубляться на территорию Ирака, так как в этом случае они должны были осуществлять дозаправку над территорией Ирака. Бомбардировщики B-52G, не выходя из воздушного пространства Саудовской Аравии, осуществили пуск КР с подкрыльевых пилонов в 80 км от границы с Ираком. Удары ракетами AGM-86C наносились по восьми высокоприоритетным целям (центры связи, системы ПВО и аэродромы), расположенным в районе г.Мосул (северный Ирак). Всего было выпущено 35 КР с семи самолетов B-52G. Из них примерно 30 КР поразили намеченные цели, в работе бортового оборудования четырех ракет произошли отказы. Для выполнения этой операции эскадрилья самолетов В-52 совершила самый длительный в истории воздушных операций перелет с континентальной части США по маршруту протяженностью около 22500 км. Самолеты находились в воздухе 34 ч 20 м, были осуществлены четыре дозаправки топливом в полете.