В 1571 г. монастырь, как и вся царская столица, был разорен и сожжен крымчаками хана Девлет-Гирея. После этого были возведены новые башни и стены. И когда в 1591 г. крымская орда под водительством Казы-Гирея вновь пошла штурмом на монастырь, артиллерия сумела достойно встретить нападавших и штурм был отбит; это был последний набег крымчаков на Москву. (Правда, по другим данным, Казы-Гирей повернул на юг уже от Коломны и до Новодевичьего не дошел.)
Однако монастырь известен не только в связи с событиями военными. Он тесно связан с династической историей русских государей. Там была похоронена малолетняя дочь Ивана Грозного Анна, там закончили свои дни жена брата Ивана IV– княгиня Ульяна, вдова старшего сына Ивана Грозного Елена, вдова Царя Федора Иоанновича – Ирина Годунова.
Овдовевшая царица Ирина прибыла в Новодевичий монастырь на девятый день после смерти мужа и постриглась в монахини, приняв имя Александры. Вскоре в монастырь явился ее брат, боярин Борис Годунов, долгие годы бывший правителем России при Федоре Иоанновиче. В некоторых источниках встречается упоминание о том, что именно в Новодевичьем состоялось его избрание на царство. Это не совсем точно: в монастыре Борис только дал согласие на избрание.
Сохранилась такая запись современника об этом событии (21 февраля 1598 г.): «Народ неволею был пригнан приставами, нехотящих идти велено было и бить, и заповедь положена: если кто не придет, на том по два рубля править на день. Приставы понуждали людей, чтобы с великим кричанием вопили и слезы точили. Как слезам быть, когда сердце дерзновения не имеет? Вместо слез глаза слюнями мочили. Те, которые пошли просить царицу в келью, наказали приставам: когда царица подойдет к окну, то они дадут им знак, и чтобы в ту же минуту весь народ падал на колена; нехотящих били без милости».
Согласно официальной версии события развивались следующим образом: с утра из Москвы двинулся к монастырю крестный ход. Впереди несли икону Владимирской Божьей матери. Годунов вышел навстречу, лег ниц перед иконой и долго орошал землю слезами. После обедни патриарх со всем духовенством, в священных одеждах, с крестом и образами пошли в келью к царице и били ей челом со слезами долго, стоя на коленях; с ними пошли бояре и все думные люди, а дворяне, приказные люди, гости и весь народ, стоя у кельи и по всему монастырю и около монастыря, упали на землю и долго с плачем и рыданием вопили: «Благочестивая царица! Помилосердствуй о нас, пощади, благослови и дай нам на царство брата своего Бориса Федоровича!» Этот рассказ воспроизводит в «Истории России с древнейших времен» С. М. Соловьев.