Неукоснительно выполнял Иван положенное всякому послушнику келейное правило, причем впоследствии, по принятии рясофора в 1851 году и пострижении в мантию в 1854 году с именем Исаакий, все более и более ревностно относился к совершенствованию своего внутреннего духовного мира, не давая себе поблажек ни в чем: был строг в понуждении себя к умному деланию, посещению монастырских богослужений и ограничивал себя в еде и отдыхе.
Не без искушений, конечно, жил молодой подвижник в скитском безмолвии. Сам он рассказывал, что исконный враг рода человеческого сильно возмущал его душу помыслами оставить святую обитель, куда Сам Господь по молитвам старцев привел его для пользы душевной. "Волнуемый такими мыслями, — говорил он, — шел я однажды по дорожке вдоль скитской ограды. "Ай махнуть через ограду", — мелькнул помысл. Но, образумившись, подумал: "Да уж если уходить, так ведь и вороты не затворены". Такое, хотя нечаянное, противоречие помыслу, с призыванием помощи Божией ослабило брань".
19 июня 1855 года отец Исаакий был рукоположен в иеродиакона, а 8 июля 1858 года — в иеромонаха. И по принятии сана преподобный Исаакий остался таким же скромным, искренним и открытым в отношении с братиями, каким был прежде, но еще строже и требовательнее к себе, во всем полагаясь на духовные наставления старца.
Возможно, так, в исполнении послушаний, монашеских правил, соблюдении церковного устава, в духовном совершенствовании и постепенном восхождении от силы в силу (Пс. 83, 8), и прошла бы вся его жизнь в монастыре. Но Богу было угодно другое.
Предвидя скорую свою кончину, преподобный Моисей, посетив святителя Филарета Московского, заранее испросил его благословения на избрание иеромонаха Исаакия настоятелем монастыря после своей кончины. А в 1860 году преставился ко Господу и преподобный Макарий, передав своего ученика, отца Исаакия, преподобному Амвросию. В 1862 году скончался преподобный Моисей, и иеромонах Исаакий был избран настоятелем монастыря, а в 1864 году возведен в сан игумена.
Преподобный Исаакий I начал исполнять должность настоятеля обители, которую принял с огромным долгом в 12 000 рублей. В течение тридцати двух лет управлял он монастырем, продолжая начатое еще преподобным Моисеем строительство, по тем временам немалое. Его же стараниями был достроен храм Всех святых на новом кладбище, сооружен новый иконостас в Казанском соборе и перестроен старый во Введенском, произведена новая роспись стен, построена монастырская больница с аптекой для бесплатного пользования, с церковью при ней во имя святого Илариона Великого, книжная лавка, двухэтажное здание рухлядной