В отличие от прежних русских храмов, Петропавловский собор имеет внутри форму огромного, вытянутого с запада на восток на 61 метр зала. Мощные пилоны членят помещение на три одинаковых по высоте (15 м) коридора-нефа. Через огромные стекла - по три с каждой стороны - в солнечные дни в собор льется поток света. По вечерам и в ненастье интерьер освещают пять вполне светских люстр из хрусталя, синего стекла и позолоченной бронзы. Оформление по-протестантски сдержанно, кирпич стен расписан под мрамор. Под сводами - восемнадцать картин на евангельские сюжеты, написанных специально для собора в 1728-1731 годах Андреем Матвеевым (главным портретистом Петра), Игнатьевым и Георгом Гзелем. И картины (раньше в православных храмах их не водилось), и обилие света, и, наконец, сам характер церковного зала близки лютеранским церквям Северной Европы.
Католическое влияние чувствуется в барочном иконостасе работы украинского архитектора Ивана Зарудного. Сооружение высотой в 30 метров не помещается в основном объеме собора, и верхняя его часть уходит в подкупольное пространство. Отдельные части иконостаса вырезаны из липы и мореного дуба московскими резчиками. В соборе они монтировались, покрывались гипсом, рыбьим клеем, позолотой. Собрали все только в 1726 году. Колоссальной величины арка царских врат, круглые скульптуры, эффектная арка, похожая на беседку, - все это абсолютно не похоже на русские иконостасы и напоминает скорее соборы Мюнхена и Праги. Всего здесь 43 иконы московской школы. Две большие иконы по обе стороны царских врат изображают Богоматерь с Младенцем (по преданию, имеющую портретное сходство с Екатериной I) и Иисуса в патриаршей тиаре и одежде московских царей. Икону с апостолом Петром, расположенную над надгробием императора, окружают четыре малые иконы с изображением князей-святых: Борис, Глеб, Александр Невский, царевич Дмитрий. Перед иконостасом находятся кафедра (на ней вырезаны фигуры титульных святых собора - апостолов Петра и Павла) и царское место - возвышение, на котором стояли во время службы императоры.
Порывая с Москвой, Петр перенес из кремлевского Архангельского собора в еще недостроенный Петропавловский династическую усыпальницу Романовых. Первое исторически достоверное захоронение в соборе относится к 1715 году, когда здесь в присутствии Петра и Екатерины была погребена их двухлетняя дочь Наталья. Отдельно, под колокольней, рядом с входом, захоронен запытанный в крепости насмерть царевич Алексей, его жена кронпринцесса Шарлотта и сестра царя Мария Алексеевна.