К 1890 году труды Павлова получили признание со стороны ученых всего мира. С 1891 года он заведовал физиологическим отделом Института экспериментальной медицины, организованного при его деятельном участии, одновременно оставаясь руководителем физиологических исследований в Военно-медицинской академии, в которой проработал с 1895 по 1925 год.
В 1897 году свой экспериментальный материал и теоретические положения Павлов блестяще обобщил в классическом труде «Лекции о работе главных пищеварительных желез», который очень скоро был переведен за границей.
В своих исследованиях Павлов использовал методы механистической и холистической школ биологии и философии, которые считались несовместимыми. Как представитель механицизма Павлов считал, что комплексная система, такая, как система кровообращения или пищеварения, может быть понята путем поочередного исследования каждой из их частей; как представитель «философии целостности» он чувствовал, что эти части следует изучать у интактного, живого и здорового животного. По этой причине он выступал против традиционных методов вивисекции, при которых живые лабораторные животные оперировались без наркоза для наблюдения за работой их отдельных органов.
Считая, что умирающее на операционном столе и испытывающее боль животное не может реагировать адекватно здоровому. Павлов воздействовал на него хирургическим путем таким образом, чтобы наблюдать за деятельностью внутренних органов, не нарушая их функций и состояния животного. Мастерство Павлова в этой трудной хирургии было непревзойденным. Более того, он настойчиво требовал соблюдения того же уровня ухода, анестезии и чистоты, что и при операциях на людях.
Используя данные методы, Павлов и его коллеги показали, что каждый отдел пищеварительной системы – слюнные и дуоденальные железы, желудок, поджелудочная железа и печень – добавляет к пище определенные вещества в их различной комбинации, расщепляющие ее на всасываемые единицы белков, жиров и углеводов.
Павлов установил факт принципиальной важности: такая тонкая и яркая изменчивость рефлекторной деятельности слюнных желез обусловлена специфической возбудимостью разных рецепторов ротовой полости к каждому из этих раздражающих их агентов, и сами эти изменения носят приспособительный характер.
На протяжении всей своей научной работы Павлов сохранял интерес к влиянию нервной системы на деятельность внутренних органов. В начале двадцатого века его эксперименты, касающиеся пищеварительной системы, привели к изучению условных рефлексов. В одном из экспериментов, названным «мнимым кормлением», Павлов действовал просто и оригинально. Он проделал два «окошка»: одно – в стенке желудка, другое – в пищеводе. Теперь пища, которой кормили прооперированную и вылеченную собаку, не доходила до желудка, вываливалась из отверстия в пищеводе наружу. Но желудок успевал получить сигнал, что пища в организм поступила, и начинал готовиться к работе: усиленно выделять необходимый для переваривания сок. Его можно было спокойно брать из второго отверстия и исследовать без помех.