В посланиях к Курбскому царь упрекал бояр в ненависти к Анастасии, которую они сравнивали с Евдоксией; Сильвестру и его друзьям она была «единого ради малого слова непотребна». Курбский, говоря о смерти царицы, упоминает о клевете на Сильвестра и Адашева, «аки бы счаровали ее оные мужи». Как и было принято в теремах, занималась рукоделием, вышивая пелены, покровцы, плащаницы, воздухи для церквей. Некоторые из них сохранились по сей день.
Царица родила шестерых детей, большинство из которых умерло во младенчестве. Ее здоровье было подорвано частыми родами и болезнями. В 1559 году она серьезно заболела. Во время этой болезни у царя случилось столкновение с кем-то из советников, которых он и так подозревал в нерасположении к Захарьиным, и которые, со своей стороны, считали Захарьиных главною причиною своего падения.
Из-за московского пожара 1560 года царицу увезли в село Коломенское, где она вскоре скончалась. Версию об отравлении Анастасии поддерживает исследование ее останков, проведенное в 2000 году по инициативе заведующей археологическим отделом музеев Кремля Татьяны Пановой. Вместе со специалистами из Бюро судебно-медицинской экспертизы Комитета здравоохранения Москвы геохимики провели спектральный анализ сохранившейся темно-русой косы царицы. В значительной концентрации обнаружены ртуть, мышьяк, свинец. По оценкам ученых такого количества ртути, которая была главным ядом той эпохи, не могло накопиться даже при ежедневном использовании средневековой косметики, для которой типично было высокое содержание соединений ядовитого металла. Таким образом, версия об отравлении подтверждается. На похоронах Иван рыдал и «от великого стенания и от жалости сердца» едва держался на ногах».
Всю жизнь он вспоминал об Анастасии с сожалением и сравнивал с ней последующих жен. Смерть Анастасии Романовны, наступившая при обстоятельствах, позволяющих предположить отравление, стала причиной резкого психологического кризиса Ивана Грозного. Подозревая окружающих в ее убийстве, он начал первую заметную кампанию террора против бояр и ближних советников. А ведь до 1560 года отношения Ивана с высокопоставленными придворными были уже достаточно напряженными, но только с этого времени принято говорить о переходе к террору.
Сам царь во втором послании к Курбскому писал: «…а и с женою меня вы про что разлучили? Только бы у меня не отняли юницы моея, ино бы Кроновы жертвы не было». Также Иван указывал, что «и отравами царицу Анастасию изведоша». Князь Курбский в «Истории о великом князе Московском» писал, что в смерти жены, вызванной, по мнению Иоанна Грозного, «чародейством», царь обвинил своих бывших советников священников Сильвестра и А. Ф. Адашева. Доказательств прямых не было, кроме показаний польки Магдалены, тайной католички, жившей в доме Адашева, которые были добыты под пыткой. На совместном заседании Боярской думы и освященного Собора во главе со святителем Макарием, митрополитом Московским, обвиняемые были осуждены. Со смертью же царицы Анастасии царь стал гневлив и весьма блудлив: «умершей убо царице Анастасии нача царь яр быти и прелюбодействен зело».