Непонятно, на что рассчитывала Мария: она до конца своих дней не переставала заявлять о своих правах на английский престол, что не могло не раздражать Елизавету, и, кроме того, она была очевидно моложе и красивее английской королевы – а та никогда не терпела рядом с собой конкуренток. Возможно, Мария надеялась на сословную солидарность: особы королевской крови должны помогать друг другу. Однако Елизавета не пожелала добывать трон для своей соперницы ценой собственных войск: вместо этого она избрала роль арбитра, начав расследование гибели Дарнли. Противники Марии не замедлили предъявить английской королеве так называемые «письма из ларца»: документы, захваченные у слуг Босуэла после его бегства. Там были любовные письма Марии Стюарт, датированные временем ее замужества, полные страсти стихи, адресованные Босуэлу, и прочие компрометирующие королеву документы. Современные историки убеждены, что большинство «писем из ларца» – грубые подделки, однако следствию хватило и их. Хотя напрямую следствием не было сказано о виновности Марии, ее отречение было признано законным, а сама она осталась пленницей английской короны.
Ее поместили в замке Шеффилд: у нее был собственный штат прислуги и даже небольшой двор, расходы на который покрывались из английской казны и французских «вдовьих денег». Однако неугомонная Мария все не успокаивалась: она по-прежнему заявляла свои претензии на английский трон и беспрестанно хлопотала о возвращении ей шотландской короны – известно, что она вела переписку со многими католическими державами. Правда, никаких активных действий она не вела, ограничиваясь лишь осторожными намеками и высказываемыми шепотом мечтами. Но английская оппозиция, недовольная слишком жестким правлением Елизаветы, в ее лице получила в свое распоряжение живое знамя, возможную претендентку на трон: а этого Елизавета простить не могла. Марию перевозили из замка в замок, постепенно ужесточая условия ее содержания, пытались или сломать, или обвинить в злом умысле, однако низложенная королева научилась быть осторожной. Девятнадцать лет Мария Стюарт провела пленницей на английской земле – и ни разу Елизавета не пожелала с нею встретиться.
Наконец в 1586 году Марию – возможно, обманом – вовлекли в очередной заговор. В письме к Энтони Бабингтону она неосторожно поддержала идею о свержении Елизаветы – и именно это послание было перехвачено королевскими агентами. Участь Марии была решена: теперь у Елизаветы было весомое доказательство ее злого умысла. Вскоре Мария Стюарт предстала перед судом, который счел ее виновной в государственной измене и приговорил к смертной казни.