. Особенность процесса трансформации заключается в том, что в одну бактериальную клетку попадает лишь одна рекомбинантная молекула ДНК. После этого, благодаря отбору, размножаются только бактерии с рекомбинантными ДНК, содержащими требуемые нуклеотидные последовательности.
Для изучения структуры генома необходимо не только клонировать все его участки в виде рекомбинантных молекул, но, главное, расшифровать в них последовательность нуклеотидов, т. е. «прочесть» ДНКовый текст.
Важным моментом во всей этой генно-инженерной «кухне» было создание принципиально новой технологии размножения индивидуальных фрагментов ДНК in vitro. Этот удивительно простой метод получения фрагментов ДНК в неограниченном количестве копий был придуман при необычных обстоятельствах — ночью, во время автомобильной поездки в горах Калифорнии. Автор этой идеи нобелевский лауреат Кэри Б. Мюллис так вспоминает момент озарения. «Иногда удачная идея приходит в голову совершенно неожиданно. Со мной, например, это случилось в одну из апрельских ночей в 1983 г., когда я, сидя за рулем автомобиля, пробирался по освещенной луной горной дороге в секвойные леса Северной Калифорнии. Мысль моя случайно натолкнулась на процесс, благодаря которому можно получать копии генов в неограниченных количествах. Теперь он называется «полимеразной цепной реакцией». За создание новой технологии ее автор получил Нобелевскую премию.
Полимеразная цепная реакция (сокращенно ПЦР) дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получать 100 миллиардов идентичных по структуре молекул. Эта реакция довольно проста в исполнении: нужны лишь ДНК, пробирка, несколько реагентов и источник нагревания и охлаждения. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть получен и из кусочка ткани, и из капли засохшей крови, и из засушенной мумии, и даже из тела мамонта, пролежавшего несколько тысяч лет в вечной мерзлоте. Суть этого метода изображена на рис. 14 на цветной вклейке.
Сама процедура ПЦР заключается в следующем. Прежде всего, ДНК денатурируют, нагревая ее до 98 °C. При этом две цепи ДНК, относительно слабо связанные между собой, разделяются друг от друга. Далее в ход идут так называемые затравки (праймеры) — короткие однонитевые фрагменты ДНК, которые комплементарны краям того участка генома, который собираются размножать (амплифицировать). Эти затравки гибридизуются с комплементарными участками однонитевых молекул ДНК, после чего специальный фермент (ДНК-полимераза) удлинняет затравки, строя молекулу ДНК по матрице (цикл 1). Затем продукты реакции вновь денатурируют и процедуру повторяют необходимое число раз. За 20–30 циклов из одной молекулы можно получить миллионы копий ДНК. Этот процесс подобен цепной ядерной реакции, но осуществляется в пробирке с помощью специального фермента — термостабильной ДНК-полимеразы. По этой причине он и получил название полимеразной цепной реакции.