После смерти Юлия II на папский престол под именем Льва X был избран Джованни Медичи, что прочно связало Флоренцию с политикой Папского государства, позиции которого резко усилились. Это привело к очередной перемене в расстановке политических сил в Италии. Венеция заключила союз с Францией, папа — с Испанией. Противоборствующие группировки столкнулись в битве при Мариньяно в сентябре 1515 г. Победу одержало объединенное франко-венецианское войско во главе с королем Франциском I. Теперь Франция и Венеция безраздельно господствовали в Ломбардии. Договор 1517 г. закрепил сложившееся положение. Но уже в 1519 г. ситуация снова изменилась: избранный в Германии императором молодой Карл V Габсбург, соединивший этот титул с обладанием испанской короной, стал крупнейшим властителем в Европе, лелеявшим планы создания мировой державы. Он немедленно заявил о своих претензиях на Милан, поставив целью изгнание французов из Италии.
Активные военные действия между ним и Франциском I начались в 1521 г. и завершились битвой при Павии весной 1525 г. Французы были разбиты, а сам король Франциск I оказался в плену. Не встречая больше сопротивления, испанские войска вели себя в Италии все более разнузданно и безнаказанно грабили страну. Весной 1527 г. они захватили Милан. Объединившиеся в 1526 г. в Коньякскую лигу Генуя, Флоренция, Милан, Папское государство, к которым присоединилась и Франция, не сумели этому противостоять. Разгул жестокости и насилия иноземцев в
Италии достиг предела, когда в мае 1527 г. немецкие наемники Карла V и его испанские солдаты захватили Рим. Они подвергли пыткам и издевательствам жителей города, убили более тысячи человек, причем погибло множество женщин и детей"Рим был разграблен, многие здания разрушены, пострадали и античные памятники. Разграбление Рима стало крупнейшим национальным унижением Италии в годы войны. Изнуренные ею стороны заключили в августе 1529 г. мир в Камбрэ. Карл V получил титул «короля Италии» и право на владение Неаполитанским королевством, за Францией остался Пьемонт. Большая часть страны оказалась под властью Испании. Однако прочного мира все равно не было — соперничество Франции и империи Габсбургов продолжалось еще тридцать лет, вплоть до заключения мира в Като-Камбрези в 1559 г. Он закрепил преобладающее влияние Испании на полуострове. Под ее юрисдикцией оказались Неаполитанское королевство с островами Сицилия и Сардиния, Миланское герцогство, ряд приморских территорий Тосканы. Многие небольшие государства попали в фактическую зависимость от Испании. Независимость сохранили республики Венеция и Генуя, герцогства Савойское и Тосканское, Папская область. Мир в Като-Камбрези подвел черту под Итальянскими войнами.