В 1396 году, пытаясь остановить растущую власть турок, был начат еще один Крестовый поход. Собралась 100-тысячная международная армия, которую возглавил старший сын герцога Бургундского. В нее вошли в основном французы, бургунды и немцы, а также отряды из Англии под командованием графа Хантингдона, сводного брата короля Ричарда. Его цель стала занятая турками территория за Дунаем. Крестоносцы рассчитывали, что, когда турецкая армия будет разгромлена, они смогут пройти по Анатолии и повторить успех Первого крестового похода, освободив Иерусалим. Госпитальеры вместе с генуэзцами и венецианцами должны были обеспечить корабли. Флот под командованием великого магистра Филибера де Найака отправился на север в Черное море и встал в районе устья Дуная в ожидании действий. После нескольких начальных успехов армия подошла к Никополю, важному укрепленному городу на Дунае. Армия стала лагерем вокруг города, желая заморить его голодом и заставить сдаться, а флот проследовал вверх по течению, чтобы предотвратить поставку продовольствия в Никополь с воды.
Крестоносцы мало что узнали за века, и даже не привезли с собой осадные машины, способные пробить стены. Они разбили лагерь и спокойно ждали, надеясь, что город попадет к ним в руки без дальнейших усилий. А в это время турецкий султан быстро вел свою армию. Она состояла в основном из легкой кавалерии, которая оказалась достойным соперником старомодным рыцарям на тяжелых конях. Результат был практически неизбежным. В последовавшем сражении турки остались хозяевами на поле боя. Мало кто из рыцарей остался в живых. Исключение составили лишь те, кто мог себе позволить уплатить огромный выкуп победившему султану. Сами госпитальеры, хотя и пострадали не так сильно, как остальные, тем не менее оказались проигравшей стороной. Это поражение окончательно и навсегда отвратило западноевропейцев от всех возможных крестоносных авантюр. Как отметил сэр Стивен Рансимен, «никопольский Крестовый поход был последним из крупных международных Крестовых походов. Характер его грустной истории следует с достойной сожаления точностью характеру великих и катастрофичных Крестовых походов прошлого…».
Однако была одна заметная разница: последний Крестовый поход был, в сущности, оборонительным. Вместо того чтобы направляться в сердце врага на мусульманских территориях, он должен был помешать мусульманам продвинуться дальше в Европу. Та же неадекватность военных приготовлений, те же разногласия между соперничающими лидерами и та же безрассудная импульсивность на поле боя привели к катастрофе. Главный урок, который извлекли госпитальеры из этой кампании, заключался в том, что отныне они были сами по себе. Больше не будет больших экспедиций из Европы. Они также осознали, что, если море дало им мобильность для нападения на врага, оно же дало им мобильность, чтобы отступить и не быть взятым в плен или убитым, как сухопутные воины. В общем, подтвердилось все то, что они узнали за годы, проведенные на Родосе. За исключением очень редких случаев – да и те относились к категории набегов с моря, а не сухопутных кампаний – рыцари теперь были повенчаны с морем на четыре столетия.