Кроме вновь выпускаемых, переоборудовалась и часть ранее выпущенных самолетов Пе-3.
Выпуск Пе-3бис прекратили в начале 1943 года, в первую очередь в связи с отсутствием двигателей М-105Р после перевода производства Пе-2 на маловысотный М-105ПФ.
В 1944 году была предпринята попытка возобновить выпуск истребителя, но ни замысел создания высотного истребителя с гермокабиной, ни двухпушечного истребителя на базе Пе-2 не был реализован, а созданный в итоге Пе-3 образца 1944 года, вооруженный одной пушкой ШВАК и двумя УБТ, не превосходил по своим данным Пе-3бис и был выпущен всего в 19 экземплярах.
Одним из первых получивших на вооружение Пе-3 (совместно с бомбардировщиками Пе-2) – 9-й скоростной бомбардировочный авиаполк, осуществлявший прикрытие железнодорожных участков Москва – Загорск и Москва – Дмитров, с октября 1941 года по февраль 1942-го доложил об уничтожении одиннадцати немецких самолетов (в том числе шести Bf.109). Другой задачей, выполняемой экипажами полка, стало лидирование групп штурмовой и бомбардировочной авиации и сопровождение полетов транспортников с членами правительства и высшего командования РККА на борту. За 8 месяцев боевой работы полк потерял в воздушном бою всего один Пе-3. Летчики другой воинской части, имевшей на вооружении Пе-3 – 54-го Краснознаменного скоростного бомбардировочного полка, – во время боев под Москвой, осуществив около 400 боевых вылетов, сбили в воздушных боях 6 самолетов противника, уничтожили 22 танка и свыше 780 единиц автомобильной техники, потеряв 11 машин. А пилоты 208-го бап занесли на свой боевой счет 34 танка, 212 автомашин, 6 железнодорожных составов и 33 сбитых самолета противника, недосчитавшись 10 своих истребителей.
Благодаря возможности продолжительное время находиться в воздухе Пе-3 активно использовались в авиации Северного флота, где осуществляли патрулирование и прикрытие морских конвоев. Летчики 95-го Краснознамённого истребительного авиаполка ВМФ, воевавшего в составе ВВС СФ, имели на счету 12 сбитых немецких самолетов врага (в том числе 9 побед, из которых, по немецким данным, подтверждено минимум 4, было одержано во время действий в составе ВВС флота и 3 – при защите Москвы в составе 6 авиакорпуса ПВО).
До прекращения выпуска в марте 1944 года в войска было поставлено, по разным данным, от 360 до 397 Пе-3 всех модификаций, при этом боевые потери составили 77 машин.
Еще одной военной специализацией Пе-2 стала функция разведчика, чему способствовали высокая скорость и возможность размещения фотоаппаратуры. На первом этапе в этом качестве использовались серийные бомбардировщики, а с августа 1941 года часть самолетов различных серий уже в заводских условиях выпускалась в варианте оборудованного фотоаппаратурой разведчика, которые, как правило, имели больший запас топлива и несколько лучшие летные данные и не оборудовались воздушными тормозами. Также выпускались разведчики и на базе Пе-3, общее число выпущенных разведывательных самолетов оценивается от 500 до 600 машин.