Князь Федор Волоцкий относился к монастырю Иосифа как к источнику потенциальных доходов. Он «занимал» деньги у монастыря, часто навещал его со своей свитой и злоупотреблял гостеприимством Иосифа. Однажды, сообщая Иосифу о его предстоящем визите, он попросил Иосифа угостить его и его свиту медом, а не квасом; мед был любимым алкогольным напитком в древней Руси и стоил значительно дороже, чем квас.287 Федор рассчитывал также на богатые дары, такие, как лошади лучших пород, оружие и драгоценные камни. Вскоре он действительно стал угрожать Иосифу изгнанием с Волоцкой земли.288
В отчаянии Иосиф обратился через своего друга, боярина Кутузова, к Василию III с просьбой освободить его монастырь из-под власти князя Федора и передать его в ведение великого князя. Одновременно Иосиф попросил санкции на это у митрополита Симона. Симон согласился поддержать прошение Иосифа, и Василий взял монастырь Иосифа под свою защиту. Однако здесь было препятствие. С точки зрения канонического права, никакое решение подобного характера не могло быть проведено в жизнь без одобрения архиепископа Серапиона Новгородского. Во всяком случае, последний должен был быть поставлен в известность. Согласно биографу Иосифа, монаху Савве Черному, Иосиф намеревался это сделать, но не смог из-за эпидемии чумы в Новгороде. Монах Савва добавляет, что сам великий князь обещал уладить дело.289 Убедительность этих утверждений сомнительна.
Когда князь Федор получил известия о приказе Василия III, лишающем его богатейшего монастыря в его княжестве, он впал в ярость и после совещания с настоятелем еще одного Волоцкого монастыря направил жалобу архиепископу Серапиону. Последний ожидал, что Иосиф, по крайней мере, объяснится. Не получив извинений от Иосифа, Серапион направил ему суровое послание, запрещая отправлять священные обряды и принимать святое причастие. Иосиф немедленно пожаловался митрополиту Симону, который решил проконсультироваться с советом епископов. Было решено отменить Серапионово отлучение Иосифа и вызвать своевольника в Москву для объяснений. Серапиона судили, признали виновным, сместили с новгородского престола и заключили в Андрониковом монастыре в Москве (1509 г.).290 С тех пор новгородский епископский престол оставался вакантным на протяжении семнадцати лет. Вероятно, действия Серапиона были истолкованы как нечто вроде восстания Новгорода против Москвы.
Князь Федор Волоцкий умер в 1513 г., после чего его удел вошел в состав Великого княжества Московского.
Иосиф одержал верх в споре с Серапионом, но средства, с помощью которых он достиг своей победы, вызвали негодование многих священнослужителей и бояр и смутили даже некоторых последователей его учения. Кое-кто из учеников умолял Иосифа извиниться перед Серапионом, но он решительно отказался делать это.