Только спустя три года Манассеин возвратился на службу, став исправляющим должность мирового посредника в Мещевском уезде Калужской губернии. Вскоре его приметил прокурор Московской судебной палаты Д. А. Ровинский и 7 июля 1866 года назначил товарищем прокурора окружного суда. В то время, по словам А. Ф. Кони, Манассеин был «блестящий, страстный и одаренный громадной энергией» чиновник. Именно эти качества нравились Ровинскому и, спустя три месяца, он направил Николая Авксентьевича в Калугу, прокурором окружного суда. В 1869 году преемник Ровинского — Г. Н. Мотовилов перевел Манассеина в Московскую судебную палату, назначив своим заместителем.
2 июня 1870 года 35-летнему Манассеину был доверен ответственный пост прокурора Московской судебной палаты. На этой многотрудной и беспокойной должности в полной мере раскрылся организационный талант Николая Авксентьевича. По отзывам современников, он был «безупречно чистым» человеком, умел ценить свое достоинство, отличался «идеальной ревностью к службе» и «гуманным отношением к людям». Он знал все тонкости прокурорской работы, умело находил себе способных помощников, блестяще организовывал судебные процессы. А. Ф. Кони отмечал, что Манассеин во главе московской прокуратуры проявил «огромное трудолюбие и энергию, направленные на служение Судебным уставам верой и правдой». По его мнению, это был «настоящий человек на настоящем месте».
Н. А. Манассеин не был «кабинетным» прокурором. Его часто можно было встретить на заседаниях суда или же просто прохаживающимся по коридорам и заглядывающим в кабинеты судей и прокуроров. При этом он зорко следил за всеми делами — никакая мелочь не ускользала от его пристального взгляда. Прокуроры знали, что ни одно допущенное ими нарушение не пройдет незамеченным строгим начальником. Старейший судебный репортер Е. И. Козлинина, хорошо знавшая Манассеина, писала, что он был «в высшей степени доступен для всех, у кого встречалась к нему надобность. Простота обращения Н. А. Манассеина была отличительной его чертой».
Манассеин занимал должность прокурора Московской судебной палаты более семи лет. В декабре 1877 года он был назначен директором департамента Министерства юстиции, сменив на этом посту А. Ф. Кони, а в сентябре 1880 года ему было повелено присутствовать в Правительствующем сенате. Наиболее впечатляющий след на этом поприще оставила его «стремительная и разрушительная», по выражению А. Ф. Кони, ревизия Лифляндской и Курляндской губерний. Проверка продолжалась 15 месяцев и потребовала от Николая Авксентьевича огромного напряжения всех духовных и физических сил. Вскоре после ее окончания он тяжело заболел. В письме от 14 января 1884 года он писал своему другу: «Мое молчание объясняется долгою и серьезною болезнью; теперь хотя и поправляюсь, но медленно. Я едва не отправился на тот свет (было такое опасение 3–4 дня); началось с конца ноября с брюшного тифа, но я, не зная, что со мною делается, думал, что меня так себе ломает и лечил себя сам большими приемами хины, за то, потом, свалился как пласт… Спасибо докторам (мой брат с Генрихсен), занялись мною преусердно, и вот теперь, спустя месяц, поставили меня на путь, по-видимому, благополучного выздоровления, за исключением только головы, которая пока никуда не годится, и потому никакая умственная работа для меня невозможна; при этом доктор строжайше требует, чтобы я, по крайней мере, месяц еще ничего не делал. Чувствую, что он прав, а между тем именно теперь-то мне до зарезу нужно приниматься за серьезную работу, потому что болезнь задержала мой Всеподданнейший рапорт и все другие исполнительные труды для разных министерств (по ревизии)».