Республиканцы называли И-16 «моска». Дело тут, вероятно, отнюдь не в гипотетическом сходстве самолета с мошкой. На ящиках, в которых прибывали в Испанию самолеты крупными буквами было написано «МОСКВА». «МОСКВА» превратилось в «МОСКу».
Боевое крещение истребителя И-16 пришлось на период Гражданской войны в Испании 1936–1939 г.г. Первые самолеты данного типа доставили из Советского Союза на Пиренеи в октябре 1936 г. Вместе с партией из 31 истребителя И-16 тип 5 прибыли летчики 1-й бригады из Брянска. Тремя эскадрильями командовал капитан Тархов.
Уже первое появление 9 ноября 1936 г. истребителей И-16 в небе Мадрида радикально изменило характер воздушной войны. Фактически И-16 стал первым в мире истребителем, способным перевести воздушный бой в вертикальную плоскость, уйти от «карусели» на виражах. Главными противниками истребителей советской конструкции являлись итальянские Фиат CR-32 и германские Хейнкель Не-51. Летчики этих самолетов быстро осознали угрозу, исходившую от И-16, и старались принимать с ними в бой, только имея на своей стороне численное превосходство. У республиканцев самолеты И-16 получили прозвище «Моска» (мошка), сторонники Франко прозвали самолет «Боинг» (за внешнее сходство с американским истребителем) и «Рата» (крыса».
Вторая партия, состоявшая также из 31 самолета, прибыла в Испанию 7 мая 1937 г., 21 мая на Пиренеи доставили еще 17 одноместных И-16 и четыре двухместных И-16УТИ. Самолеты сопровождали летчики, большая часть которых служила в 142-й авиационной бригаде, базировавшейся в Бобруйске. Вместе с советскими летчиками прибыла и небольшая группа испанских пилотов, прошедших курс обучения в Кировобадском авиационном училище. К этому времени в небе Испании с самолетами И-16 произошло несколько катастроф, причиной которых послужила недостаточная прочность узлов навески элеронов. При маневрировании с большими перегрузками в ходе воздушного боя, крепления элеронов разрушались, элероны отрывались и самолет терял управляемость. Инциденты отозвались репрессиями в Советском Союзе. В духе того времени начался поиск виновных в саботаже «врагов народа». Впрочем, настоящую причину отрыва элеронов также установили. В результате была усилена конструкция 150 крыльев, кроме того заменили обшивку элеронов. Четырнадцать истребителей до 1 июля прошли доработку на месте, в Испании, 10 августа 1937 г. в Испанию прибыли 62 самолета, модернизированных в заводских условиях.
Эксплуатация истребителей И-16 в условиях фронта выявила множество других дефектов. Так, колеса основных шасси с пневматиками размерами 750x100 оказались слишком узкими для работы с испанских аэродромов, которые отличались каменистым грунтом. Отскакивающие от колес при взлете и посадки камни повреждали горизонтальное оперение. Дефект устранили путем установки пневматиков размерами 750x150 и дополнительной обшивкой нижних поверхностей стабилизатора и рулей высоты. Источником постоянных проблем стал фонарь кабины. Козырек забрызгивался маслом, поэтому для улучшения обзора летчики старались фиксировать фонарь в открытом положении, однако при маневрировании фонарь самопроизвольно закрывался. Неожиданным плюсом стала чрезмерная задняя центровка самолета. Случаев капотирования почти не отмечалось даже при грубых посадках на неподготовленные площадки.