В июне 1894 года началась у него предсмертная болезнь дизентерия, не раз посещавшая его и прежде, которая истощила все его старческие силы. 20 августа последовал удар, после которого старец уже не мог говорить, но пребывал в сознании и причастился Святых Таин.
Преподобный Исаакий I почил о Господе 22 августа /4 сентября 1894 года.
Всечестные мощи преподобного старца Исаакия I были обретены 31 января /13 февраля 1995 года при восстановительных работах в храме Казанской иконы Божией Матери. По благословению священноархимандрита Оптиной пустыни, Святейшего Патриарха Московского и всея Руси Алексия II, в половине третьего того же дня сии святые мощи были благоговейно подняты и, по совершении литии наместником обители священноархимандритом Венедиктом (Пеньковым) с сослужащими, были перенесены в Введенский собор, где с того времени не прекращалось чтение Псалтири и совершались литии. На 3-й день после праздника Сретения Господня началось приуготовление всечестных мощей старца к их переоблачению.
Дивным смотрением Божиим накануне дня памяти святого великомученика Феодора Стратилата, которому вместе с великомучеником Георгием посвящен тот придел Казанского храма, где покоились мощи старца, перед полиелейной службой великомученику, вечером 7/20 февраля, приехал Преосвященный Стефан, епископ Пинский и Лунинецкий (впоследствии — архиепископ). Незадолго до этого владыка Стефан (Корзун) так же неожиданно был в Оптиной у всечестных мощей старцев Моисея и Антония после их обретения. После полиелея святому Феодору Стратилату владыка Стефан отслужил заупокойную литию. Невольно вспомнились слова епископа Калужского Виталия при отпевании преподобного старца Амвросия в 1891 году: "Теперь я вижу, что это старец пригласил меня на отпевание… Этот старец так велик, что его непременно должен был отпеть епископ".
Явное и преславное чудо милости Божией совершилось 6/19 февраля, вскоре по перенесении честных мощей старца Исаакия I. Очевидцами было засвидетельствовано чудо истечения святого мира от иконы Живоначальной Троицы во Введенском соборе.
Дивный во святых Своих Бог, в Троице славимый, прославил и паки прославит угодника Своего преподобного старца Исаакия, молитвами которого да обрящем и мы светлость святых.
Ныне святые мощи преподобного Исаакия I покоятся в левом приделе Казанского собора монастыря.
Преподобне отче наш Исаакие, моли Бога о нас!