Смерть Микалая Чёрного стала серьёзным испытанием для кальвинистов Великого Княжества. Богословские споры разгорелись внутри евангельско-реформированного Объединения с неслыханной силой и привели к разделению единого реформированного збора на так называемый больший збор - собственно кальвинистов, верных учению Жана Кальвина, и меньший збор - так называемых ариан, или антитринитариев, которые сами называли себя литовскими братьями. Основной причиной разделения стал вопрос о Троице и крещение детей. Литовские братья, подчёркивая, что Иисус Христос был на 100% человеком, при этом нередко отрицали Его равенство Богу Отцу, а также считали, что каждый человек должен креститься только взрослым, осознавая, что он делает. Такие утверждения вызывали ожесточённые споры, однако так и не создали чёткой границы между большим збором и меньшим, и это позволяет судить, что известные нам крайние высказывания той или другой стороны говорились скоре в пылу дискуссии, чем отражали повсеместно принятую богословскую позицию. Многие сторонники литовских братьев одновременно не порывали с большим збором, как например, староста брестский Ян Кишка, который был главным покровителем меньшего збора в Великом Княжестве. Тем не менее, споры и разделения внутри реформационного движения ослабили позиции реформаторов накануне тех событий, которые ожидали наше государство.
Война с Москвой, которая продолжалась уже много лет, остро поставила перед Великим Княжеством давний вопрос об унии (союзе) с Польским Королевством. Военная машина Московского государства, направленная на завоевание новых земель, значительно превосходила оборонительные возможности Княжества, и наша страна серьёзно ощущала недостаток собственных сил, чтобы противостоять восточному агрессору. В 1563 году начались переговоры делегации Великого Княжества с представителями Польской Короны об условиях объединения государств. Польская сторона, ссылаясь на старые акты времён Ягайлы, настаивала на создании единого государства, но беларуские послы во главе с Микалаем Радзивилом Чёрным принципиально настаивали на сохранении независимости Великого Княжества. Споры длились не один год, тем временем война продолжалась, ослабляя страну. Шляхта, на плечах которой лежала основная тяжесть войны, всё громче требовала унии, соглашаясь на польские условия.
Наконец в январе 1569 года в Люблине собрался совместный сойм Великого Княжества Литовского и Польского Королевства, чтобы рассмотреть вопрос о союзе. Делегация Княжества вновь решительно не согласилась с идеей включения своей страны в состав Польского Королевства и в знак протеста покинула Люблин. Тогда Жигимонт Август, пользуясь своей властью великого князя литовского, присоединил к Польскому Королевству Подляшье, Волынь и Киевщину, тем более, что тамошняя шляхта была более всех благосклонна к унии, надеясь найти таким образом защиту от Москвы и от татар. Вильня была шокирована таким ходом событий, даже раздавались голоса о войне с Польшей, но если с западным соседом можно ещё было вести переговоры, то с Иваном Грозным говорить было не о чем: там, где проходили московские войска, оставалась выжженная земля. Послы Княжества снова приехали в Люблин, чтобы отстаивать самостоятельность своего государства и прийти к какому-то компромиссу. 1 июля 1569 года был объявлен акт создания Речи Посполитой Двух Народов - федерации Польского Королевства и Великого Княжества Литовского, которая имела одного короля и одну внешнюю политику, но две армии, два скарба (финансовые системы), два сборника законов.