Блестящий ученый, экспериментатор, Гамалея во всех своих помыслах и исканиях всегда неотступно думал о требованиях жизни, был неразрывно связан с современной практикой.
Много энергии и труда приложил Гамалея к разработке способов борьбы с сибирской язвой, свирепствовавшей в царской России. Изучив результаты прививок против сибирской язвы у животных, он сумел создать свою теорию так называемой вакциональной лихорадки. Он доказал, что вакцина действует только в том случае, если она вызывает у животного повышение температуры. Значит, делает он вывод, существуют особые вещества, образующиеся в организме вслед за введением вакцины и вызывающие это повышение температуры.
Современная медицинская наука располагает разнообразными вакцинами против оспы, чумы, сибирской язвы, бешенства, бруцеллеза, гриппа для профилактики заразных болезней людей и животных. Подавляющее большинство их — живые вакцины, то есть препараты, состоящие из живых, но специально измененных возбудителей заболеваний — бактерий или вирусов. Наряду с живыми вакцинами применяются и убитые вакцины, например против брюшного тифа, полиомиелита, холеры, сыпного тифа. Кроме того, применяются вакцины химические, приготовленные из отдельных химических составных частей возбудителей. Введение в организм человека определенного количества микробных ядов способствует появлению невосприимчивости.
И. Ф. Гамалея в 1888 году впервые выдвинул мысль о создании подобных химических вакцин и предпринял интересную, увенчавшуюся успехом попытку — приготовил убитую вакцину против холеры. Идеи Николая Федоровича были восприняты во всех странах мира. Через десять лет после его опытов немецкие ученые Пфейффер и Колле доказали эффективность применения убитых вакцин против кишечных инфекций.
В России — огромное поле деятельности для врача-микробиолога. В стране вспыхивают жестокие эпидемии холеры и других заболеваний. Николай Федорович не остается в стороне от народных бедствий. С особой силой он отдается борьбе с эпидемиями после 1893 года, когда успешно защищает докторскую диссертацию и заканчивает в Военно-медицинской академии ряд исследований по изменчивости микроорганизмов под влиянием условий окружающей среды.
Ряд лет Гамалея ведет активную борьбу со вспыхивающими то тут, то там эпидемиями холеры и чумы. В то же время он изучал биологию возбудителя холеры, закономерности развития эпидемий и предложил свой план борьбы с холерой в России.
Дореволюционной России постоянно угрожала «царица болезней» — чума. Николай Федорович вел борьбу с ней в Одессе и Баку, он разработал план защиты от чумы портовых городов страны.