Наиболее вероятной наследницей английской короны была небезызвестная Мария Стюарт, шотландская королева: она была внучкой Маргариты Тюдор, старшей сестры Генриха Восьмого, и хотя линия Стюартов не была упомянута в завещании Генриха Восьмого, фактически была не последней в очереди наследников. К тому же ее права – как истинной католички, представительницы католического рода, – поддерживал Рим. Корону Шотландии она унаследовала, когда ей было всего несколько дней от роду, и страной от ее имени управляла королева-мать Мария де Гиз. Еще в раннем детстве Марию предполагалось выдать замуж за английского принца Эдуарда, однако в возрасте пяти лет она была просватана за Франциска, сына французского короля, и с тех пор воспитывалась при французском дворе. Советники убеждали ее в том, что именно у нее наиболее веское право на английскую корону – Мария даже включила английский герб в свой личный, и титуловалась как королева французская, шотландская, английская и ирландская. После внезапной смерти ее супруга, тогда короля Франциска Второго, она вернулась в Шотландию. На руку овдовевшей королевы немедленно нашлось множество претендентов – сама Елизавета предлагала ей в мужья Роберта Дадли, получившего графский титул именно по этому поводу. Однако Мария вышла за молодого, смазливого и весьма недалекого Генри Дарнли, ставшего отцом ее сына – будущего короля Якова. Однако супруги не ладили; всего через полгода Дарнли погиб при загадочных обстоятельствах, и Мария считалась одной из вероятнейших его убийц – особенно учитывая тот факт, что уже через три месяца она вышла замуж за лорда Ботвелла. Все эти события вызвали восстание в стране, в результате которого 24 июля 1567 года Мария Стюарт отреклась от престола в пользу своего сына. Она сбежала в Англию, где попросила убежища у Елизаветы.
Елизавета не была готова ни восстанавливать Марию на престоле, ни оказывать ей какую-либо помощь: Мария по-прежнему считала именно себя законной королевой Англии. Так что у Елизаветы было достаточно причин не любить Марию, помимо простой женской ревности, о которой так любят говорить писатели. По совету лорда Сесила, Марию поселили в замке Карлейл (откуда ее позднее перевели в Шеффилд, где она провела почти восемнадцать лет), давали весьма щедрое содержание, но не допускали ко двору, да и вообще никуда не выпускали.
Между тем появление Марии в Англии спровоцировало целую серию католических заговоров. Поначалу Елизавета не верила в причастность к ним Марии – или не хотела верить – но в конце концов (не без участия провокаторов) были получены неопровержимые доказательства того, что Мария замышляла убить Елизавету. Хотя английской королеве категорически не хотелось подписывать смертный приговор Марии – это было бы слишком зловещим прецедентом, – ей все же пришлось. Восьмого февраля 1587 года Мария была казнена.