В 1560 году Франциск скоропостижно скончался: официально причиной его смерти был назван нарыв мозга, случившийся из-за нарыва в ухе, но Екатерина не преминула обвинить в смерти сына его молодую жену, шотландскую королеву Марию Стюарт: будто бы она была столь охоча до постельных удовольствий, что вконец лишила короля сил. Марии пришлось немедленно покинуть Францию, а на трон взошел десятилетний Карл IX.
Карл, очень похожий на отца и внешне, и характером, обожал мать: во всем ей послушный, он уже на коронации во всеуслышание заявил Екатерине, что «она всегда будет рядом с ним и сохранит право управлять, как это было до сих пор». И Екатерина правила практически безраздельно. В жены сыну она подыскала мягкую и послушную Елизавету Австрийскую – невестка была всем хороша, кроме одного: у нее так и не было сына.
Но Екатерину это не очень огорчает: она родила достаточно детей, чтобы обеспечить преемственность. Куда больше ее волновали все усиливающиеся религиозные распри между католиками и гугенотами: до поры до времени Екатерина умело лавировала между двумя лагерями, не отдавая никому предпочтения и сохраняя равновесие сил. Хотя она выросла при папском престоле, вопросы веры ее не сильно волновали: она искренне считала религиозные споры лишь отголоском политических разногласий, которые вполне возможно примирить, если действовать с умом и тактом.
В конце концов Екатерина сделала решительный шаг: она пообещала свою дочь Маргариту в жены Генриху, королю Наварры и вождю гугенотов. Она надеялась таким образом ослабить партию Гизов, которые имели слишком большую власть, однако со временем ее планы изменились.
Гугеноты поднимали одно восстание за другим, и католики немедленно отвечали на каждое резней и погромами. В то же время король Карл все больше и больше попадал под влияние адмирала Колиньи – фактического главы гугенотской партии. Тот даже смог уговорить Карла объединиться с Англией и объявить войну Испании – чего Екатерина допустить не могла. Она убедила сына, что Колиньи устроил заговор против него: единственным спасением было убить Колиньи и его сторонников-гугенотов. Говорят, раздавленный ее аргументами король воскликнул: «Во имя Господа, убейте их всех!»
В ночь на 24 августа 1572 года началась резня, которая вошла в историю под именем Варфоломеевской ночи: адмирал Колиньи и многие другие гугеноты, приехавшие на свадьбу Генриха и Маргариты, были зверски убиты. Следом начали убивать простых горожан, виновных или заподозренных в гугенотской ереси. Генрих Наваррский уцелел – его спрятала в своих покоях Маргарита, а когда убийцы пришли за ним, он поклялся перейти в католичество. Резня в Париже продолжалась еще неделю, а по Франции ее отголоски слышались в течение месяца. По разным оценкам, погибло от трех до десяти тысяч человек, и далеко не все они были гугенотами.