Поначалу Мария была без ума от мужа: она выполняла все его прихоти и даже позволяла ему подписывать государственные документы – причем его подпись стояла прежде ее. Но постепенно она разочаровалась в нем: Дарнли оказался тщеславным, легкомысленным, жадным, трусливым, эгоистичным и недалеким. Едва забеременев, королева стала открыто пренебрегать прежде любимым мужем, проводя все больше времени с новым фаворитом – своим секретарем итальянцем Давидом Риччо, красавцем и талантливым музыкантом. По слухам, он заменил Дарнли и в постели королевы, однако современные историки склонны этому не верить: беременность Марии протекала тяжело, и ей было не до плотских утех. Однако Дарнли так не считал: обезумевший от ревности и обиды, он составил заговор против пронырливого итальянца – его соратниками стали участники возглавляемой графом Мореем и Джеймсом Дугласом, графом Мортоном, протестантской оппозиции, недовольные обилием католиков-иностранцев в окружении королевы. Девятого марта 1566 года вооруженные заговорщики ворвались в покои к Марии, где та ужинала в окружении приближенных, и на ее глазах зверски убили Риччо: на его теле потом насчитали 57 ножевых ран. Саму королеву по приказу мужа заперли в покоях – якобы из опасения за здоровье ее ребенка.
Заговорщики надеялись, что сломленная горем и страхом королева подчинится их требованиям, однако Мария оказалась хитрее: она сумела убедить мужа в том, что ему, как и ей, грозит опасность – почувствовавшие вкус крови заговорщики уничтожат всех католиков у трона и сами захватят власть. Дарнли покорился жене: вместе они бежали в замок Данбар, где собрали войско, командовал которым Джеймс Хепберн, граф Босуэл, талантливый военачальник и верный соратник королевы. Вскоре Мария во главе восьми тысяч солдат вошла в Эдинбург: она примирилась с братом, графом Мореем, которого в ночь убийства не было в Эдинбурге, и в то же время решительно расправилась с Мортоном и его сподвижниками. В знак благодарности Босуэл получил замок Данбар.
19 июня 1566 года Мария родила сына Джеймса, будущего короля Якова. Ее отношения с Дарнли окончательно ухудшились: он даже не присутствовал на крестинах собственного сына. Уже скоро стало ясно, что Мария без памяти влюбилась в другого: лорд Босуэл был человек сильный, мужественный и энергичный, короче – совершенно не похож на слабохарактерного и трусливого Дарнли. Легенда гласит, что страсть Марии вспыхнула при не самых романтических обстоятельствах: возбужденный красотой королевы граф однажды ночью влез в окно ее спальни и попросту изнасиловал ее, а после галантностью и раскаянием добился сначала прощения, а затем и любви. Уже осенью 1566 года их роман перестал быть тайной для окружающих: один из мемуаристов писал, что когда Мария узнала о ранении Босуэла, она сбежала с заседания королевского суда и одна, в бурю, помчалась верхом в его замок, дабы справиться о его здоровье.