После окончания академии иеромонаха Феофана назначают ректором Киево-Софийских училищ, этот пост он занимает около пяти лет. В 1844 году его переводят в Санкт-Петербургскую духовную академию на должность бакалавра по кафедре Нравственного и Пастырского богословия, а через два года причисляют к соборным иеромонахам Александро-Невской лавры. Однако Феофан подаёт прошение об увольнении и по собственному желанию становится членом создаваемой Русской духовной миссии в Иерусалиме. На Востоке будущий святитель основательно изучил греческий и французский языки, ознакомился с еврейским и арабским. Вид Палестины, её холмов и долин, светлых озёр наполняет душу отца Феофана священными воспоминаниями. В 1855 году он становится настоятелем посольской церкви в Константинополе, где многое узнаёт об Афоне и его подвижниках. В 1859 году архимандрит Феофан посвящается в епископский сан с назначением сначала на Тамбовскую, а затем на Владимирскую кафедру, где он открывает женское епархиальное училище и издает «Владимирские епархиальные ведомости». Также он много путешествует, проповедует, заботится о духовно-учебных заведениях и открывает новые церковно-приходские школы, которые на тот момент для многих людей были единственной возможностью получить образование.
С 1871 года архимандрит Феофан решает полностью посвятить себя служению Богу и предаётся полному затвору в Вышенской пустыни, затерявшейся в лесах Тамбовской губернии. Для совершения богослужения святитель Феофан устроил себе маленькую церквушку, выделив для этого часть гостиной. Вместо иконостаса была простая занавесь из дешёвой ткани, которая отделяла алтарь от остальной части церкви. В свою келью, кроме келейника, духовника и настоятеля обители, которые приходили к нему иногда, Феофан Затворник никого не пускал. Узнав о великом подвижнике, люди со всех сторон стали писать святителю письма, в которых обращались к нему за советом. Не нарушая своего затвора, Феофан не отказывал никому в духовном наставлении. Ежедневно он писал около 40 ответных писем, в них он наставлял людей, рекомендовал, утешал, предостерегал и давал бесценные советы. Святитель Феофан в одном из своих писем более чем за 50 лет вперёд предсказал Октябрьскую революцию.
Перед праздниками Рождества и Пасхи, получив пенсию, Феофан Затворник почти всю её рассылал по почте разным бедным и родным, оставляя себе лишь немногое на необходимые скромные потребности. Другим людям безвозмездно высылал свои книги.
Порядок обыденной жизни святителя Феофана Затворника был незатейливым. После окончания утренней литургии он пил чай, затем занимался умственными работами, плодами которых были его многочисленные книги и письма. В час дня святитель обедал, его трапеза в последние годы состояла только из одного яйца и стакана молока. В четыре часа Феофан Затворник снова пил чай, а ужина не было совсем. В постные дни ещё больше усиливалось телесное воздержание святителя-подвижника, которого питали и укрепляли только духовные занятия и молитвенные подвиги.