Альфонсо попытался найти подход к Венеции, но получил отпор. Геральдический лев святого Марка хлестнул его хвостом за то. что он посмел без разрешения вторгнуться в его владения. Альфонсо умиротворил понтифика тем, что пресек попытку Бентивольо вернуть себе Болонью. После возобновил семейную политику сближения с Францией. 20 апреля 1509 года папа назначил Альфонсо гонфалоньером (Гонзага отнесся к этому с презрением). Затем понтифик отлучил Венецию от Церкви, и началась война. 14 мая в сражении при Аньяделло огромная венецианская армия, насчитывавшая 50 тысяч наемников, была разбита французскими и папскими войсками. Хотя противник в полной мере этого еще не осознал, притязаниям Венеции на власть в Италии пришел конец. Макиавелли осудил венецианцев «за кичливость богатством и трусость перед превратностями судьбы».
Они полагали, — писал он, — что богатство пришло к ним благодаря их способностям, а на самом деле особенными талантами они не отличались. Они задирали нос, смотрели на французского короля как на сына, недооценивали силу Церкви, считали, что вся Италия мала для удовлетворения их амбиций, и хотели создать империю, подобную Римской. Когда же судьба повернулась к ним спиной и французы их разбили… они потеряли большую часть территории не только из-за предательства своих людей, но из-за собственной трусости. Большую часть того, что ранее завоевали, они сдали папе и королю Испании.
Война была стихией Альфонсо: при обороне своего государства он выказал храбрость, целеустремленность и политическую мудрость. Воинственный кардинал, Ипполито умело помогал ему. Первым делом герцог удалил ненавистный символ венецианского владычества — вицедоминуса, представитель дожа на подвластных Венеции землях, — занозу, что засела в боку Феррары в последнюю войну с Венецией. Затем он вежливо отозвал из Венеции своего посла. Венецианцы ответили тем, что конфисковали его дворец. Более важным для экономики Феррары стало то, что герцог вернул земли, захваченные венецианцами. В число этих земель входил и Эсте. по названию этого города семья получила свое имя. В Комаккьо он возобновил добычу соли: венецианцы запрещали там этот промысел. Затем Альфонсо повысил пошлину на товары, идущие через Феррару из Болоньи и Романьи. Венецианцев взбесила такая наглость, и в декабре они направили против него флот по реке По. Флот этот потерпел унизительное поражение. Сила Альфонсо зиждилась на тесном его союзе с Людовиком (не самый, надо сказать, надежный союзник), да и понтифику этот союз очень не нравился. Папа обрушил свою злобу, ксенофобию и агрессию на герцога Феррары.