Однако после пяти лет брака семейная идиллия была прервана. Мария, которая находилась на позднем сроке беременности, умерла вследствие несчастного случая на охоте. 24 марта 1482 года Максимилиан и Мария отправились на охоту. Лошадь герцогини понесла и сбросила всадницу. Травмы оказались тяжелыми, началось внутреннее кровотечение, и три дня спустя двадцатипятилетняя женщина скончалась. Для Максимилиана это означало не только личную трагедию, но и политическое поражение, поскольку, в отличие от супруги, он не пользовался большой популярностью у своих новых подданных. Герцогом Бургундским провозгласили маленького сына Максимилиана и Марии, Филиппа (позднее прозванного Красивым), однако отцу ребенка в регентстве было отказано. Борьба между Максимилианом и мятежными городами Нидерландов и Фландрии продолжалась до 1494 года, когда старший Габсбург официально передал сыну власть над этими провинциями.
Максимилиан долгое время не мог смириться с утратой — в течение многих лет после смерти жены, он, по некоторым данным, брал с собой в путешествие гроб с ее останками. После преждевременной смерти Марии ему формально стала принадлежать власть над Бургундией и Нидерландами, что делало его одним из самых могущественных европейских монархов. Однако часть бургундского наследства быстро досталась Франции. Еще когда Фридрих III был жив, Максимилиан был выбран римским королем, его коронация состоялась в Ахене 9 апреля 1486 года. В это время он вмешался в войну за наследство Карла Смелого в Нидерландах. С февраля по май 1488-го он находился в плену в Брюгге, откуда его освободил отец, прибывший туда со своими войсками. Конфликт закончился в 1489 году Франкфуртским миром. Год спустя Сигизмунд Тирольский передал Максимилиану власть над Тиролем. Тем самым было закончено более чем столетнее разделение Габсбургов на Альбертинскую и Леопольдинскую линии. Центральным городом Австрии в это время стал Инсбрук, в который Максимилиан перенес свой двор. Именно в Тироле он провел первые административные реформы, образцом для которых стала Бургундия времен его тестя Карла Смелого (после смерти отца похожие реформы он начал проводить на землях Нижней Австрии).
Бургундское наследство, полученное Габсбургами в результате брака Максимилиана I и Марии, заключалось не только в территориальных приобретениях. Своеобразной частью этого наследства стал орден Золотого Руна, основанный в 1429 году бургундским герцогом Филиппом Добрым. Орден, знак которого представляет собой золотого барашка на ленте, носимой на шее, был основан как некое мистическое крестоносное братство «новых аргонавтов», призванных отправиться в поход за легендарным золотым руном, под которым в данном случае подразумевался Гроб Господень. Символика ордена, как утверждает исследовательница имперской идеологии Габсбургов Мария Таннер, весьма сложна и объединяет в себе целый ряд мифологем. Здесь и античное предание о героях-аргонавтах, и астрологическое значение Овна, олицетворяющего начало всех начал, первого знака в зодиакальном цикле из 12 созвездий, и древний «золотой век», повторное наступление которого, по канонам христианства, сопряжено со Вторым Пришествием Иисуса, и апокалиптический символ Христа — образ Агнца Божьего.