Со временем коллекция Медичи, включавшая в себя наряду со скульптурой также живописные полотна работы тогдашних итальянских художников, уже не могла вместиться в неприспособленных помещениях и встал вопрос о сооружении специального здания музея. Но в этом, как оказалось, не было необходимости, потому что возводимый рядом с Палаццо Веккьо огромный дворец для административных служб Флорентийской республики (отсюда и название «Уффици», то есть — офисы, конторы, учреждения) не мог быть использован по назначению, поскольку Медичи к тому времени покончили в своем государстве с республиканскими порядками, установив тираническое правление.
Проект палаццо Уффици был разработан Джорджо Вазари (1511–1574), архитектором, живописцем и историком искусства, который обессмертил свое имя среди потомков не только художественными творениями, но и прославленными «Жизнеописаниями» выдающихся мастеров итальянского Возрождения. Грандиозный дворец строгой, торжественной архитектурой должен был подчеркивать величие и свободолюбивые традиции города-государства и центра художественной жизни Италии того времени. Из окон дворца, построенного в форме буквы П и выходящего двумя крыльями к суровой крепостной глыбе Палаццо Веккьо, а легкой аркадой перемычки — к берегам Арно, открывался по мере передвижения по бесконечным коридорам Уффици захватывающий вид на море красных черепичных крыш, над которыми вставали то тут, то там стройные силуэты колоколен и крепостных башен. И все это — в обрамлении изумительного по красоте зеленого ожерелья окрестных холмов, в виду голубого зеркала реки, необъятных далей, в которые уносит свои воды Арно…
Палаццо Уффици, построенный таким образом, что он служил как бы драгоценной рамой для восхитительных картин природы и созданий человека, рукотворных шедевров, был идеальным местом для размещения там коллекции Медичи. Соответствующая перестройка здания была осуществлена уже после смерти Вазари архитектором Буонталенти, но знаменитый коридор длиной около километра, соединивший (для удобства Медичи) палаццо Уффици с палаццо Питти и приютивший со временем Галерею автопортретов художников, был проложен автором первоначального проекта и носит его имя — Вазарианский коридор.
До 1737 года расположившаяся в Уффици коллекция хотя и была открыта для публики, принадлежала герцогам Медичи, пока не пресеклась мужская линия правителей города. После этого по воле сестры последнего великого герцога из рода Медичи Анны-Марии-Лодовики собрание было передано в общественное пользование, «чтобы украсить достойным образом государство, служить на благо публики и привлекать к себе любознательные чужестранцев».