Поначалу собственно музей занимал только верхний этаж одного крыла здания, но с увеличением коллекции он постепенно вытеснял другие учреждения, пока не занял его почти целиком. Однако со временем гигантский комплекс палаццо Уффици стал тесен для огромного количества собранных здесь произведений искусства, и от Уффици мало-помалу стали отпочковываться другие музеи, которые ныне пользуются заслуженной славой и известностью во всем мире: Музей Барджелло, где сосредоточены шедевры пластического искусства эпохи Возрождения, Археологический музей, в который были переданы произведения античного искусства, Музей Академии, Музей монастыря Сан Марко, стены которого были расписаны Фра Беато Анджелико и где также выставлена часть его живописных работ, Музей серебра, собравший произведения ювелирного искусства.
В палаццо Уффици же осталась лишь живописная коллекция и часть античной скульптуры, в том числе знаменитая Венера Медицейская. Галерея автопортретов, как уже говорилось, также была отделена от общей экспозиции и переведена в Вазарианский коридор. В залах Уффици, таким образом, была развернута не имеющая себе равных по богатству и значению в истории мирового искусства выставка шедевров итальянского Возрождения. Ее открывают мастера Проторенессанса — Чимабуэ, Джотто, Дуччо ди Буонинсенья, Симоне Мартини, продолжают великие художники раннего Возрождения — Мазаччо, Пьеро делла Франческа, Поллайоло, Филиппо Липпи, Боттичелли и венчают гении Высокого Возрождения — Леонардо да Винчи, Микеланджело, Рафаэль, Тициан. Ни в одном другом музее не представлено так полно и так исчерпывающе творчество титанов итальянского Возрождения, как в Уффици, где хранятся произведения, без которых невозможно вообразить развитие мировой художественной культуры. Достаточно назвать такие хрестоматийно известные вещи, как «Весна» и «Рождение Венеры» Сандро Боттичелли, «Поклонение волхвов» Леонардо да Винчи, «Святое семейство» Микеланджело Буонарроти, «Автопортрет», портрет папы Льва X и «Мадонна со щегленком» Рафаэля, «Флора» и «Урбинская Венера» Тициана. А рядом с ними в залах Уффици висят сотни творений других выдающихся итальянских мастеров, а также виднейших представителей европейских художественных школ: Дюрера, Кранаха, Хольбейна, Рембрандта, Рубенса, Ван-Дейка. Экспозицию завершают два недавно приобретенных Уффици полотна великого испанского живописца Гойи.
Но это если говорить собственно о пинакотеке — картинной галерее Уффици. А кроме пинакотеки, в палаццо Уффици располагается еще Кабинет графики с его богатейшими фондами, где хранится более 100 тысяч рисунков, гравюр, литографий, выполненных не только мастерами прошлого, но и современными художниками. До наших дней доведена экспозиция и в Галерее автопортретов.