В 1519 г. произошли события, которые в корне изменили характер борьбы в Италии и расстановку политических сил в Западной Европе в целом. Испанский король Карлос I принял титул императора Карла V. Новый глава Священной Римской империи, являвшийся одновременно внуком королей-объединителей Изабеллы Кастильской и Фердинанда Арагонского (по линии отца) и Максимилиана I Габсбурга (по линии матери), собрал под своей властью обширнейшие территории Испании и Империи и лелеял средневековый идеал «универсальной империи» – эпицентра всего христианского мира. Теперь Францию почти отовсюду окружали владения Габсбургов и ей противостояла вся мощь объединенных испано-имперских сил.
Первая франко-габсбургская война (1521–1526), главным образом за обладание Миланом, шла с переменным успехом. Военные действия происходили также на северофранцузской и наваррской границах и в Провансе. Развязка наступила в 1525 г., когда французская армия была разгромлена имперцами в битве при Павии (в Ломбардии), а сам король Франциск I Валуа Ангулем (1515–1547) попал в плен. Франциска отправили в Мадрид и посадили в тюрьму как простого узника и выпустили только после того, как он подписал предъявленные ему условия: отказ от Милана и возвращение Бургундии. После этого французский король смог вернуться на родину, оставив при испанском дворе своих детей в качестве заложников.
Известие о результатах сражения при Павии всколыхнуло Италию. Стало ясно, что, если не изменить ход событий, итальянским государствам останется только склониться перед волей всемогущего победителя. В 1526 г. во французском городе Коньяке был заключен союз между Венецией, Флоренцией, папой Климентом VII и не собиравшимся выполнять навязанные ему обязательства Франциском I. Протектором Коньякской лиги объявил себя король Англии. Истинными хозяевами Лиги являлись итальянцы, они же составили основу ее армии. Однако раздоры среди членов Лиги и нерешительность военных операций не позволили итальянцам изгнать имперцев из Ломбардии. Это дало возможность Карлу V 6 мая 1527 г. взять Рим. Немецкие ландскнехты и испанские солдаты подвергли город и его окрестности страшному разгрому и опустошению. Поход французской армии на юг Италии (повторивший маршрут Карла VIII Валуа) и осада Неаполя союзным флотом Франции и Венеции окончились неудачей.
Вторая франко-габсбургская война (1526–1529) завершилась подписанием Кабрейского мира. Франциск полностью отказался от притязаний на Италию и сюзеренитета над фактически принадлежавших Карлу Фландрией и Артуа. При этом французский король был освобожден от условия возвращения Бургундии, а его дети были отпущены из плена. Для итальянских государств разгром Коньякской лиги означал крах их последней попытки вести самостоятельную политику в борьбе между Францией и Империей. На Болонском соборе 1530 г. Климент VII короновал поработителя Италии Карла V немецкой и итальянской коронами. Однако борьба за Италию не прекратилась. В действие вступили новые факторы, которые ослабляли Империи – борьба в Германии между католиками и протестантами, приобретшая международное значение, переход инициативы в соперничестве на Средиземном море в руки Османской империи, новое вторжение турок на территорию Юго-Восточной Европы.