Живописью, наоборот, занимался мало. Изабелла д'Эсте в 1506 году еще два раза обращалась к нему и лично и через третьих лиц с напоминанием о своей старой просьбе: написать ей отрока Христа. Леонардо отвечал вежливо и почтительно, но уклончиво. Маркиза в конце концов обиделась и прекратила с ним знакомство. Но была одна живописная работа, от которой Леонардо не только не уклонялся, а, наоборот, отдавался ей с какой-то страстью. Ей было посвящено все время, остававшееся у него от работы над «Битвой при Ангиари». Это был портрет моны Лизы дель Джокондо, портрет, который под именем «Джоконды» стал одной из самых знаменитых картин в мире.
Вазари, рассказывая о портрете моны Лизы, описывает его с необыкновенной подробностью. Ни одно другое произведение ни одного другого художника, даже кумира Вазари Микеланджело, не удостоилось такого тщательного анализа. Вот что говорит Вазари: «Взялся Леонардо выполнить для Франческо дель Джокондо портрет моны Лизы, жены его, и, потрудившись над ним четыре года, оставил его недовершенным. Это произведение находится ныне у французского короля в Фонтенбло. Это изображение всякому, кто хотел бы видеть, до какой степени искусство может подражать природе, дает возможность постичь это наилегчайшим образом, ибо в нем воспроизведены все мельчайшие подробности, какие только может передать тонкость живописи. Поэтому глаза имеют тот блеск и ту влажность, какие обычно видны у живого человека, а вокруг них переданы все те красноватые отсветы и волоски, которые поддаются изображению лишь при величайшей тонкости мастерства. Ресницы, сделанные наподобие того как действительно растут на теле волосы, где гуще, а где реже, и расположенные соответственно порам кожи, не могли бы быть изображены с большей естественностью. Нос со своими прелестными отверстиями, розоватыми и нежными, кажется живым. Рот, слегка приоткрытый, с краями, соединенными алостью губ, с телесностью своего вида, кажется не красками, а настоящей плотью. В углублении шеи при внимательном взгляде можно видеть биение пульса. И поистине можно сказать, что это произведение было написано так, что повергает в смятение и страх любого самонадеянного художника, кто бы он ни был. Между прочим, Леонардо прибег к следующему приему: так как мона Лиза была очень красива, то во время писания портрета он держал людей, которые играли на лире или пели, и тут постоянно были шуты, поддерживавшие в ней веселость и удалявшие меланхолию, которую обычно сообщает живопись выполняемым портретам. У Леонардо же в этом произведении улыбка дана столь приятной, что кажется, будто бы созерцаешь скорее божественное, нежели человеческое существо; самый же портрет почитается произведением необычайным, ибо и сама жизнь не могла бы быть иной».