В 1821 году по приглашению епископа Калужского Филарета (Амфитеатрова) братья Моисей и Антоний (Путиловы) с монахами Иларием (Дранкиным) и Савватием прибыли в Оптину пустынь для постройки там Иоанно-Предтеченского скита и основания в нем монашеской жизни. В 1822 году святитель Филарет рукоположил отца Моисея в сан иеродиакона, а затем — иеромонаха и вскоре назначил общим духовником Оптиной пустыни. С 1826 года и до своей кончины он был настоятелем монастыря.
В 1837 году иеромонах Моисей был возведен в сан игумена, а в 1853 году — архимандрита. Настоятельство преподобного Моисея отмечено активным строительством на принадлежавших монастырю землях. Построены два придела Введенского храма, выстроена новая трапезная и семь братских корпусов. В 1858 году в старой трапезной устроена и освящена церковь во имя преподобной Марии Египетской и святой праведной Анны. В 1861–1864 годах построена кладбищенская церковь во имя Всех святых. Возведены каменная ограда с семью башнями, библиотека, гостиницы (восемь корпусов с тремя флигелями). Построены два конных двора, скотный двор, кирпичный и черепичный заводы, мельница. Устроен хутор для лугового хозяйства и рыбной ловли на реке Жиздре, приобретены и подготовлены под огороды болотные земли, разбиты фруктовые сады.
Но главной настоятельской заботой архимандрита Моисея было попечение о братии, ее преуспеянии в деле спасения души. В годы его настоятельства в Оптиной пустыни зарождается старчество: он приглашает в обитель преподобного Льва, он же возлагает бремя духовного окормления братии на его последователя — преподобного Макария. При нем приходит в Оптину послушником будущий великий светильник земли Русской преподобный Амвросий. Благодаря тому, что отец Моисей прошел тот же духовный путь внутреннего делания, что и отец Лев, между обоими строгими подвижниками возникло глубокое взаимопонимание и полное единодушие. И если епархиальное начальство не понимало сущности старчества и преследовало старца Льва, то отец Моисей, который был с ним на одном духовном уровне, понимал великое значение старчества, и между старцем и настоятелем никогда не возникало ни малейшего трения.
Большое значение придавал преподобный Моисей и делу книгоиздания. За время его настоятельства в Оптиной было издано 16 томов святоотеческой литературы.
Привыкнув еще смолоду вставать в полночь на молитву, отец Моисей и в бытность свою настоятелем едва ли не каждую ночь повторял это. По крайней мере двое из братий, бывших при нем будильщиками, говорили, что, приходя брать благословение будить братию к утрени, они часто заставали преподобного уже бодрствующим, иногда же молящимся на коленях перед образом Спасителя, а иногда еще лежащим в подряснике. Впрочем, отец Моисей и всегда, ложась спать, не раздевался. Об этом своем подвиге он нечаянно проговорился одному монаху в какой-то поездке. Приехав к вечеру на постоялый двор, они остановились кормить лошадей. Напились чаю и расположились отдыхать в разных комнатах. Не успел монах раздеться, улечься и хорошенько заснуть, как отец Моисей вошел к нему одетый и говорит: "Ну, пора нам собираться ехать. Что же ты это, брат, и разделся? Я двадцать пять лет и в своей келлии не раздевался во время сна, а ты в дороге разделся, спать ложась; в дороге какое спанье?! Поедем!".