В своей «Тайной вечере» Леонардо запечатлел тот момент, когда Христос объявляет своим ученикам: «Один из вас предаст меня». Апостолы, сидящие за длинным фронтальным столом, совершенно в тосканской манере, взволнованы, ошеломлены. В спонтанном порыве чувств они разбились на четыре группы по трое, а в центре выступает одинокая фигура Христа, удивительным образом оказавшегося в изоляции. Это ощущение изоляции усиливается сеткой ретроспектив, обращенных к нему. Сильное впечатление монументальности создается тем, что зритель, находящийся в центре трапезной, оказывается немного ниже точки действительного исхода перспективы. Это подобно театральной перспективе, в которой плоскости пола и потолка идут с уклоном, тогда как боковые плоскости, стены, представляются усеченными. Леонардо осуществляет переработку визуальной пирамиды, служившей основой теории Альберти, своего единственного наставника в области учения о перспективе. Помимо этого много и других новшеств: персонажи лишены нимбов, даже Христос, и впервые при разработке темы Тайной вечери предатель виден анфас, а не со спины. В тот момент он еще не совершил предательства, и потому нет оснований скрывать его лицо.
«Тайная вечеря» выполнена на пространстве 4 метра 60 сантиметров в высоту и 8 метров 80 сантиметров в длину. Примененная Леонардо техника письма темперой позволяла ему не только вносить дополнения и исправления, но и менять цветовую гамму ради достижения хроматической гармонии целого. Продолжая творческие поиски, он достиг такой степени элегантности и ясности стиля, которая резко контрастировала с темной и тяжелой манерой письма, присущей эпохе Средневековья. Наложение темперы, смешанной с маслом, на двойной слой штукатурки явилось действительно революционным, но вместе с тем и фатально рискованным приемом, учитывая крайне неблагоприятные атмосферные условия. Из-за повышенной влажности в трапезной со временем стал меняться первоначальный цвет красок, а затем началось и отслоение красочного слоя. Негативные изменения начались уже в 1513 году, и далее состояние этого знаменитого произведения Леонардо неуклонно продолжало ухудшаться. Как если бы хрупкость творений рук человеческих предвосхищала их судьбу, образы апостолов блекли по мере старения их моделей. «Тайная вечеря» мало-помалу покрывалась шрамами, наносимыми временем, тускнела, пропадала на глазах у публики, бессильной воспрепятствовать ее исчезновению.
Трагический финал этого последнего произведения, созданного Леонардо в Милане, заставил мастера критически пересмотреть весь миланский период его жизни. Это время вдруг представилось ему наполненным бесполезными трудами и тщетным упорством и отмеченным запоздалым признанием ввиду слишком малого количества завершенных произведений – правда, ответственность за это он не возлагал целиком на себя. Его переполняло горестное чувство, брала досада за бездарно растраченное время. Таков был итог его жизни в Ломбардии!