К Мальте подошла громадная по тем временам сила — 181 судно с 30 тыс. пехотинцев на борту. Во главе экспедиции стоял Мустафа-паша — тот самый, который уже однажды нанес ордену решительный удар, отняв у госпитальеров Родос. Турецким флотом командовал зять Сулеймана Пиали-паша, а флотилией алжирских пиратов — Тургут-реис (известный на западе под именем Драгут — «гроза морей»), способный военачальник, верой и правдой служивший Сулейману. Он тоже был «старым знакомым» госпитальеров: не кто иной, как Драгут дважды добивался серьезных успехов в борьбе с орденом, оба раза — в 1551 году, когда он изгнал рыцарский гарнизон из Триполи и опустошил Гоццо.
Турки приступили к осаде 18 мая 1565 года. Вряд ли для ла Валлетта это нападение было неожиданным: он заранее предпринял кое-какие меры организационного характера. На остров срочно были доставлены продовольствие и боеприпасы, съезжались боеспособные члены ордена и т. д. Но всего этого было явно недостаточно. Под началом великого магистра было тогда всего 700 рыцарей и около 7,5–8 тыс. солдат, в основном мальтийцев. Как отмечают старинные источники, «христианские государи, которых ла Валлетт молил о помощи, не спешили поддержать рыцарей», и орден вновь, как и на Родосе, оказался один на один с грозным врагом.
В исторические источники этот приступ с артиллерийским обстрелом форта вошел как Великая осада Мальты. Она продолжалась без малого четыре месяца (18 мая — 8 сентября 1565 г.). Гарнизон форта стоял насмерть в буквальном смысле. Только 21 июня, когда погибли все до одного его защитники, солдаты Мустафы-паши смогли войти в то, что еще оставалось от небольшой крепости. За неполный месяц турецкая армия потеряла 8 тыс. человек, от шальной пули погиб один из главных командиров осаждавших — Драгут, что вкупе с другими факторами оказало на тех сильное деморализующее влияние.
Обе противоборствующие стороны потеряли очень много солдат, но если для ордена это было смерти подобно, то турки постоянно получали подкрепление, в том числе и из Северной Африки. Так, в июле наместник султана в Алжире Хасан доставил на Мальту новый отряд, насчитывавший 2 тыс. человек, и штурм сразу же возобновился. Но ни алжирцам, ни пришедшим им на помощь янычарам так и не удалось преодолеть крепостные стены.
Когда вице-король Сицилии все-таки решил прийти на помощь Мальте, она уже истекала кровью. Однако, узнав об этом, защитники острова обрели второе дыхание и с новым упорством стали отстаивать каждую пядь земли. Несколько раз военное счастье как будто оказывалось на стороне превосходящих сил противника, но смелые действия мальтийцев в тылу турецкой армии и мужество тех, кто выдерживал лобовую атаку османов, грозили сорвать планы Мустафы-паши. С безрассудным упорством бросал он новые тысячи бессловесных солдат на, казалось бы, изнемогающих защитников форта. Силы ордена были на исходе, когда 7 сентября на горизонте показались сицилийские боевые корабли.