Чтобы быть подальше от придворных интриг, Елизавета отправилась в Ашридж, за 20 миль от Лондона. Однако и здесь ей не давали покоя. Вскоре был раскрыт заговор во главе с выходцем из нового дворянства Томасом Уайта том против испанизации страны и брака Марии Тюдор с Филиппом II. В причастности к заговору подозревали и Елизавету. Заговорщики, возлагавшие на нее надежды, убеждали ее переехать в Доннигтон, чтобы быть ближе к восстанию. А Мария, под предлогом «безопасности» Елизаветы, настаивала на том, чтобы ее вернули ко двору.
Хитрая принцесса и на этот раз намеревалась занять выжидательную позицию и прикинулась больной. Но врачи, осматривавшие ее, не увидели никакой опасности для здоровья и в сопровождении приверженной принцессе стражи отправили в Лондон. Опасения Елизаветы были не напрасны — она сразу же оказалась под строгим арестом. Положение было критическим: ее обвиняли в государственной измене как участницу неудавшегося заговора, а главными уликами против нее были якобы перехваченные и дешифрованные депеши о целях и составе заговора. Елизавету подвергли формальному допросу перед членами тайного совета под председательством Гардинера. Но она отвергала все обвинения и настаивала на полной невиновности. Однако улики представлялись достаточно вескими, чтобы заключить ее в Тауэр. Маркиз Уинчестер и лорд Суссекс явились к Елизавете и сообщили о том, что они должны доставить ее по Темзе в крепость. Было Вербное воскресенье, и, чтобы излишне не волновать народ, особым королевским указом всему населению Лондона предписывалось в это время присутствовать в церкви на богослужении. При полном безлюдии, мрачной дождливой погодой с небольшой свитой Елизавета отправилась в путь. У стен Тауэра она решительно отказалась выходить из лодки, ссылаясь на неудобное место высадки; протестуя, она падала в грязь и отвергала всякую помощь. Увидев стражу, Елизавета в недоумении воскликнула: «Неужели все эти вооруженные люди здесь для меня? Они совсем лишние, ведь я слабая женщина!» Несмотря на проливной дождь, она села на камни и отказалась войти в тюрьму. «Лучше сидеть здесь, чем там! — воскликнула Елизавета. — Я не знаю, куда вы хотите меня вести».
Два месяца пришлось провести принцессе в Тауэре в полной изоляции от внешнего мира, под строгим надзором. Королевские советники в это время внушали Марии мысль, а необходимости казни Елизаветы. Гардинер, не скрывая своей неприязни к принцессе, говорил, что бесполезно обрывать листья и обрубать ветви у ереси, когда ее корень остается неприкосновенным. Нужно, считал он, приложиться секирой к самому корню дерева. Мария, правда, не торопилась выполнять рекомендации своего канцлера и ограничилась тем, что из Тауэра Елизавету отправила в Вудстокский замок, где она находилась более года под строгим арестом. Похоже, на этот раз королеву беспокоили более важные дела: восстановление влияния католической церкви, а также вступление в брак с Филиппом Испанским. Свадьба была отпразднована, позиции католицизма укреплялись, но судьба оказалась неблагосклонной к королеве. Из-за слабого здоровья она не могла иметь детей. Поэтому Филипп собирался покинуть ее, не видя возможности без наследников утвердиться в Англии. Правда, надежды он не терял, но теперь больше был склонен поддержать Елизавету, считая, что дни Марии сочтены. Он настоял на том, чтобы Елизавету освободили из заключения. Королева, встретившись с принцессой, требовала, чтобы она признала свою вину как участница заговора. Искренне или нет, но Елизавета, коленопреклонившись перед ней, утверждала, что не может просить о помиловании, ибо не в милости нуждается, а только в правосудии.