Новодевичий монастырь стал одним из самых богатых и уважаемых в России, особенно после удаления в монастырь под именем монахини Александры царицы Ирины, вдовы царя Федора Ивановича. В монастырь перед избранием на царство ушел ее брат, правитель государства Борис Годунов. Сюда, в Новодевичий монастырь, пришли толпы москвичей во главе с духовенством, призывая его взойти на трон. В ночь на 22 февраля 1598 г., как эмоционально рассказывал Карамзин, "не угасали огни в Москве, все готовилось к великому действию - и на рассвете, при звуке всех колоколов, подвиглась столица..., жители Московские, граждане и чернь, жены и дети устремились к Новодевичьему монастырю молить Бориса о приятии царского венца". И только после долгах уговоров, после трогательных сцен: "все бесчисленное множество людей... упало на колена, с воплем неслыханным: все требовали Царя, отца, Бориса! Матери кинули на землю своих младенцев и не слушали их крика", в конце концов, Борис согласился быть царем России.
Особенно благоволила к монастырю царевна Софья, которая, думается, никак не предполагала, что ей придется окончить свои дни здесь в заточении. После разгрома стрелецкого восстания Петр 1 приказал заключить Софью в монастырь, где ей отвели караульню около северо-западной Напрудной башни. После поражения стрелецкого бунта и последующего розыска несколько стрельцов были повешены перед караульней, да "так близко к самым окнам Софьиной спальни, что Софья легко могла достать повешенных рукою", - свидетельствует очевидец.
Кроме Ирины и Софьи, из именитых монахинь в Новодевичьем монастыре жила и там же скончалась первая жена Петра - царица Евдокия. Против воли ее постригли, заключили в Шлиссельбург, потом в суздальский Покровским монастырь, а после восшествия на престол ее внука перевели в 1727 г. в Москву, в Новодевичий, отведя отдельное здание около северных ворот. У нее здесь был целый двор с гофмейстером, штатом служителей и немалым бюджетом в 60 тысяч рублей.
Практичный Петр старался получить непосредственную пользу от тысяч монастырских насельников по всей России - так, в Новодевичьем монастыре он учредил школу для кружевниц, в которой обучали этому ремеслу специально выписанные из Бельгии монашенки. Он не остановился и перед тем, чтобы поселить в женском монастыре старых заслуженных солдат: еще в 1763 г. в Новодевичьем монастыре квартировали три майора, два капитана и четыре поручика, получавшие от монастыря жалованье.
В 1812 г. монастырь уцелел благодаря храбрости монахинь - наполеоновские войска перед уходом заложили порох и зажгли фитили, но бесстрашные монахини сумели погасить их.