Царское правительство, боясь ухудшения отношений с Турцией, выразило свое недовольство казакам. Но поскольку после взятия Азова татарские набеги из Крыма резко сократились (казаки из Азова напрямую угрожали крымским берегам), царь и бояре стали слать казакам повышенное жалованье, хотя в переговорах с турками и осуждали казачье предприятие.
Казаки объявили в Азове беспошлинную торговлю, а сами готовились отбить у турок еще и Темрюк, чтобы окончательно укрепиться на Азовском море.
Турки долго не могли собраться и отвоевать Азов. Им мешала война с Ираном и смена султанов. Наконец только что вступивший на престол султан Ибрагим I назначил поход на 1641 год.
В июне огромное турецкое войско осадило город. Источники говорят, что султан послал под стены Азова 240 тысяч человек, среди них были наемники и специалисты минного дела из Европы. Семь с половиной тысяч казаков сели в осаду, отказавшись сдать город. Но это было далеко не все войско. Часть низовцев отказалась поддержать осажденных, заявив: «Лучше мы умрем за свои черкасские щепки, чем за ваши азовские камни». Но многие казаки с Верхнего Дона стали прорываться в осажденный Азов, чем оказали большую помощь защитникам.
Первый жестокий штурм был отбит, причем погибли все европейские наемники, посланные турками на стены первыми. Тогда турки блокировали город и начали минную войну – стали подводить под стены подкопы, чтобы взорвать их. Но казаки превзошли противника в этом искусстве. Против подкопов они вели контрподкопы и подземными взрывами уничтожали вражеских минеров.
Новые попытки штурма, когда турки волнами накатывались на стены в течение трех дней, тоже были отбиты. Турецкая артиллерия сровняла многие азовские стены с землей, но казаки зарылись в землю, делали постоянные вылазки и не пускали врага в город.
Турки пошли на переговоры и предложили казакам сдать город за выкуп. Те ответили: «Не дорого нам серебро и злато, дорога нам слава вечная».
В августе атаки прекратились. Последний турецкий штурм вели всего 7 тысяч добровольцев, набранных со всей турецкой армии. Турки уже не имели сил для продолжения осады. Чтобы оправдаться перед султаном, они совершили несколько набегов на близлежащие казачьи городки и 26 сентября сняли осаду с Азова. Войско Донское одержало победу, но досталась она дорогой ценой. Из осажденных уцелело чуть больше тысячи человек. Большая часть донских казаков полегла на азовских стенах.
Уцелевшие понимали, что им не удержать крепость своими силами, и после осады в Москву было послано посольство во главе с Наумом Васильевым, который сначала возглавлял оборону города. Посольство предлагало правительству «принять город под высокую руку русского государя». Но правительство после войны с поляками боялось новой войны с турками. Кроме того, было известно, что крепостные стены Азова разрушены. Поэтому в Москве отказались принять Азов у Войска Донского, а казакам посоветовали оставить город. Не имея сил для продолжения борьбы с огромной Османской империей, казаки в мае 1642 года оставили Азов. Скоро туда вошли турки.