Первые шаги королевы, несомненно, внушенные ее советниками, были, впрочем, достаточно осторожными. Она отвергла предложение послать с ней французские войска. Оставаясь католичкой, Мария остерегалась оказывать предпочтение своим католическим подданным. Протестанты, отмечал живший в XVIII веке шотландский историк У. Робертсон в своей знаменитой «Истории Шотландии», «добились декларации, чрезвычайно благоприятной для их религии. Протестантская доктрина, хотя и утвердившаяся по всей стране, никогда еще не получала поощрения или санкции королевской власти. В декларации королева объявила любую попытку изменения или подрыва протестантства самым тяжким преступлением. Королева передала дела управления страной целиком в руки протестантов. Ее тайный совет был заполнен наиболее известными лицами, принадлежащими к протестантам, ни один католик не был удостоен какой-либо степени доверия».
Мария признала протестантизм в качестве государственной религии. Две трети конфискованной церковной собственности остались в руках новых владельцев, а треть была обращена на нужды протестантского духовенства и короны. Это не мешало Марии Стюарт тайно уверять католические державы и римского папу в своем намерении реставрировать католицизм.
Несмотря на осторожный курс внутренней политики, Марии Стюарт не удалось избежать осложнений с Елизаветой. Новый брак, в который собиралась вступать Мария, имел большое политическое значение и для Англии. Претендентами на руку шотландской королевы выступали многие принцы, включая дона Карлоса, сына и наследника испанского короля Филиппа II. Елизавета предложила кандидатуру собственного фаворита — Роберта Дадли, графа Лейстера. С этой целью в апреле 1565 года в Шотландию в дополнение к послу-разведчику Рэндолфу прибыл сэр Николас Трокмортон.
Оскорбительное предложение Елизаветы было отвергнуто. В июне 1565 года Мария неожиданно вышла замуж за своего кузена Генри Стюарта, лорда Дарнлея, сына графа Леннокса. По словам одного придворного, сэра Джеймса Мелвила, Дарнлей «более напоминал женщину, чем мужчину. Он был хорошеньким, безбородым и лицом походил на даму». С династической точки зрения выбор Марии был не столь плох. Как и Мария, ее муж имел права на английский престол. Тем самым укреплялись и права любого их наследника. И все же этот выбор оказался тяжелой политической ошибкой. Супруг королевы был спесивым ничтожеством, сразу вступившим в распрю с влиятельными лордами, включая и Мерея.
Елизавета была разгневана браком Марии. Соперничество с мужем королевы объединило Мерея и Гамильтонов — старых врагов Ленноксов. Однако поднятое ими восстание было без особого труда подавлено. Мерей бежал в Англию, Елизавета публично осуждала Мерея, а втайне оказывала ему поддержку. Одержав победу над частью протестантских лордов, Мария Стюарт сочла возможным более откровенно опираться на помощь католиков и в самой стране и за ее пределами. Главным агентом католической контрреформации в Шотландии считали — без особого основания — итальянца Давида Риччио, музыканта по профессии, ставшего секретарем королевы. Влияние, которое этот выходец из Савойи приобрел на Марию, вызывало негодование лордов, видевших в возвышении выскочки-итальянца умаление своей власти. Они объясняли карьеру Риччио тем, что он будто бы являлся любовником королевы и отцом ребенка, которого она ожидала. Этот вымысел поддерживал даже Дарнлей. Он мстил Марии за нескрываемое пренебрежение, с которым она стала относиться к нему, как только раскусила, чего он стоил. Дарнлей вступил в тайный сговор с мятежными лордами, согласно которому они соглашались поддержать его притязания на власть, а он обязался не допустить конфискации имений Мерея и его союзников.