На фоне этого отношения между царем и его советниками настолько обострились, что А. Адашев нашел неудобным оставаться при дворе и отправился в почетную ссылку в Ливонию, третьим воеводой большого полка. Сильвестр, упрекавший Ивана за войну с христианами-немцами, ушел в монастырь.
Тем временем 7 августа 1560 г. после продолжительной болезни умерла царица Анастасия Романовна. При жизни жены царь учитывал мнение своего окружения и добился немалых успехов. После ее смерти он перестал слушать достойных людей и обрушил страшные кары на головы верных своих слуг. Смерть царицы имела для страны весьма тяжелые последствия. Курбский, говоря о смерти Анастасии, упоминает о клевете на Сильвестра и Адашева, «аки бы спаровали ее оные мужи». Сам царь во втором послании к Курбскому писал: «…а и с женою меня вы про что разлучили? Только бы у меня не отняли юницы моея, ино бы Кроновы жертвы не было». Несомненно, что смерть царицы тяжело отразилась на душевном состоянии Ивана и была одним из обстоятельств, обостривших его борьбу с боярством.
По приказу Ивана Грозного над Адашевым и Сильвестром состоялся суд. Адашева посадили под стражу в Дерпте, где он заболел горячкой и через два месяца скончался. Сильвестра заточили в Соловецком монастыре. Это послужило сигналом тому, что царь разрывает со своей прежней политикой и со своим стремлением к достижению компромисса между разными слоями общества.
Иван спешит покончить с прежними условиями жизни и в августе 1561 г. склоняется на просьбу митрополита Макария вступить в новый брак. Второй женой царя стала черкесская княжна Кученей, в православии Мария Темрюковна. Подозревая, что Анастасия была отравлена боярами-княжатами, Иван предпринимает ряд мер, направленных против них.
С 1561 г. он берет записи знатных бояр о неотъезде в Литву и иные места и связывает их поручными записями друг за друга. В 1562 г. издается указ о княжеских вотчинах, разрешивший наследование их только прямым потомством мужского пола, за отсутствием которого они отписывались на государя. Пошли многочисленные казни и опалы без суда, сопровождавшиеся конфискацией земельных владений пострадавших.
21 марта 1563 г. у Ивана от второй жены родился сын Василий, который вскоре умер. Умер в самом конце 1563 г. и митрополит Макарий, игравший столь значительную политическую роль при дворе царя. На его место избрали Афанасия (1564–1566), монаха Чудова монастыря и бывшего духовника царя.
В 1564 г. бежал в Литву с театра войны князь А. М. Курбский, незадолго до того назначенный воеводой в Юрьеве (Дерпте), где оставил жену и сына и написавший оттуда Ивану письмо с обвинениями в жестокости и оправданием своего поступка правом слуг царских отъехать, раз их освященное историей положение в Москве попирается царем. По существу, это было обвинение в разрыве царя с устоями, на которых держится православное царство. На это Иван ответил Курбскому обширным посланием с обвинением бояр, которые во главе с Сильвестром стремились устранить его, самодержавного богоданного царя, от всякого участия во власти, оставить ему только титул и честь «председания» в их совете, и укрепляли положение аристократии произвольной раздачей земельных приобретений Иоанна III и Василия III. Царь отверг все обвинения князя. При этом он подчеркивал, что именно тот строй, когда «Российское самодержавство изначали сами владеют своими государствы, а не бояре и вельможи», более всего соответствует устоям православного царства. Иной же порядок, когда государи «царствии своими не владеют, как им повелят работные их, так и владеют». Еще один провозглашавшийся им принцип: «жаловати есмя своих холопей вольны, а и казнити вольны же» — являлся главным принципом будущего правления Ивана Грозного.