Но союз государств прочнее не стал. Вскоре Иван III объявил великому князю войну. Летом 1500 года в кровопролитном сражении на реке Ведрош победили русские войска. С обоих сторон в битве погибло почти 8 тысяч воинов. В плен попал предводитель войска Великого княжества Литовского князь Острожский. В 1503 году Иван III согласился на мир, по которому к Московскому государству отошли земли с городами Чернигов, Гомель, Стародуб, Новгород-Северский, Любеч, Путивль, Брянск, Невель, Велиж и др. В целом Великое княжество Литовское потеряло 19 городов и 70 волостей, то есть почти все, что завоевал великий князь Витовт.
Неблагоприятная для Великого княжества Литовского внешнеполитическая обстановка осложнила и внутриполитическую, что проявилось в 1508 году в восстании Михаила Глинского. Целью Глинского было возрождение киевской монархии и возобновление Великого княжества от Литвы до Руси. Восстание, несмотря на помощь московских войск, потерпело поражение и было жестоко подавлено. Из Ипатьевской летописи:
В лето 7016 (1508) Глинский не престает пакости дея Литве, своему отечеству, и пойде паки под Менск з москвою, губя землю, поражен бысть от Жигмонта короля и з москвою, прочая же москва повергше оружия и все свое побегоша, Глинский же, со останком утекая, много земле огнем попали, Жигмонт же иде за ними; такожде огнем и мечом землю московскую пусту творя; но помирися князь московский со Жигмонтом. В то время татаре мняху, яко король умедлит у Москве, прийдоша в Литву и начаша пленити; но Константин князь Острозский, гетман, порази их и полон увесь отъят.
Московское государство добивалось важнейших целей, поставленных еще при Иване III — воссоединения всего православного населения и возвращения к былому единству Киевской Руси. Причинами военных действий между Великим княжеством Литовским и Москоским государством в 1507–1508 годах были постоянные взаимные территориальные претензии. Зимой 1507 года виленский сейм принял решение о возвращении земель, утраченных во время предыдущих двух войн. Прибывшие в Москву посольство Сигизмунда Старого в ультимативной форме потребовало вернуть города и земли, захваченные Иваном III. Московское правительство не приняло эти требования и направило конные полки на Полоцк и Смоленск. Сигизмунд организовал должный отпор, и война окончилась безрезультатно.
В 1508 году между Великим княжеством Литовским и Московским государством было подписано соглашение, по которому закреплялись границы, сложившиеся в результате предыдущих войн. Но мир продержался недолго. В 1512 году военные действия возобновились, началась четвертая война, которая длилась несколько лет. Московские войска овладели Смоленском и начала наступать в направлении Друцка и Орши, но в осенью 1514 года под Оршей 80-тысячная русская армия потерпела крупное поражение от 30-тысячного войска Великого княжества Литовского. Гетман Константин Острожский умело использовал артиллерию и разгромил противника. В битве погибло 30 тысяч русских, белорусов и литовцев.